Molekularbiologische Methoden 2.0

Dr. Thomas Reinard ist Leiter der AG Molekulare Biochemie am Institut für Pflanzengenetik der Leibniz Universität Hannover.

Vorwort zur 1. Auflage12

Vorwort zur 2. Auflage13

1 Das Leben und seine Bestandteile

1.1 Der Aufbau von DNA und RNA17

1.2 Der genetische Code20

1.3 Die Gene22

1.3.1 Die Genstruktur in Prokaryoten22

1.3.2 Genstruktur in Eukaryoten24

1.4 Proteine26

1.5 Die Zelle30

2 Grundlagen der Arbeit im Labor

2.1 Wasser34

2.2 Messung des pH-Werts35

2.3 Puffer36

2.4 Waagen36

2.5 Mikropipetten38

2.6 Gefäße im Labor40

2.7 Zentrifugen41

2.8 Mischen und Konzentrieren44

2.8.1 Konzentrieren 45

2.8.2 Pufferwechsel45

2.9 Probenlagerung 46

2.10 Steriles Arbeiten46

2.11 Geräte für den Aufschluss von Geweben49

2.12 Pflege und Aufzucht von Escherichia coli51

2.12.1 Nährmedien52

2.12.2 Antibiotika53

2.12.3 Lagerung von Bakterien55

3 Aufreinigung von Nukleinsäuren

3.1 Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen59

3.1.1 Nukleasen59

3.1.2 Scherkräfte60

3.1.3 Chemische Verunreinigungen60

3.1.4 EDTA und zweiwertige Ionen: das Yin und Yang der Molekularbiologie61

3.2 Extraktion von Nukleinsäuren62

3.3 Die weitere Aufreinigung der DNA64

3.3.1 Phenolextraktion64

3.3.2 Ethanolfällung65

3.3.3 Isopropanolfällung67

3.3.4 PEG-Fällung68

3.3.5 Entfernen von Polysacchariden mit CTAB68

3.3.6 Tropfendialyse68

3.4 Silica Matrices69

3.4.1 Von Nukleinsäuren und Silica Matrices69

3.4.2 Übersicht über den Einsatz von Kits70

3.5 Ausgewählte DNA Aufreinigungsverfahren71

3.5.1 Die Plasmidpräparation aus E. coli71

3.5.2 Die Isolation von DNA aus Pflanzen mit CTAB72

3.5.3 Isolation von DNA aus Blut oder Zellkulturen74

3.5.4 Isolation hochmolekularer DNA75

3.6 Die Isolation von RNA76

3.7 Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren78

3.8 Quantifizierung von Nukleinsäuren79

3.8.1 DNA-Bestimmung im Photometer79

3.8.2 Konzentrationsbestimmung mittels optischer Dichte81

4 Polymerase- Kettenreaktion

4.1 Prinzip der Polymerase- Kettenreaktion85

4.2 Die Komponenten der PCR86

4.2.1 Die Ausgangs-DNA86

4.2.2 Thermostabile DNA-Polymerasen86

4.2.3 Puffer, Magnesium und dNTPs89

4.2.4 Primer91

4.3 Geräte für die PCR93

4.4 Die Standard-PCR94

4.5 Ausgewählte PCR-Methoden94

4.5.1 Two-Step PCR94

4.5.2 Gradienten-PCR und Touch-Down PCR96

4.5.3 Nested PCR 97

4.5.4 Multiplex PCR97

4.5.5 Einführen von Restriktionsschnittstellen98

4.5.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)99

4.5.7 Kolonie-PCR102

4.5.8 Quantitative PCR103

4.6 Anwendungen der PCR105

4.7 Optimierung der PCR-Reaktion105

5 Klonieren für Einsteiger

5.1 Restriktionsenzyme109

5.1.1 Restriktionsenzyme des Typs II110

5.1.2 Restriktionsenzyme im Labor113

5.1.3 Methylasen und Typ IIM-Enzyme115

5.1.4 Typ IIS-Enzyme116

5.2 Ligation116

5.3 (De)Phosphorylierung von DN118

5.3.1 Dephosphorylierung118

5.3.2 Phosphorylierung119

5.4 Enzyme für spezielle Aufgaben121

5.5 Die Transformation von E. coli121

5.6 Der Weg zum klonierten Gen123

5.7 Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor123

5.7.1 Die Klonierung über eine Restriktionsstelle124

5.7.2 TA-Klonierung und TOPO-Cloning125

5.7.3 Klonierung in ein Letal-Plasmid126

5.7.4 Zyklische Blunt End Klonierung126

5.8 Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor127

5.9 Wenn es mal nicht klappt ...129

6 Vektoren

6.1 Plasmide132

6.2 Klonierungsplasmide135

6.2.1 Blau-Weiß-Screening135

6.2.2 Letalvektoren138

6.3 Expressionsplasmide 139

6.3.1 Promotoren für Expressionsvektoren140

6.3.2 Weitere regulative Sequenzen141

6.3.3 Expression in das Periplasma141

6.3.4 Einschlusskörperchen [Inclusion Bodies]141

6.3.5 Tag-Sequenzen142

6.4 Reportergene142

6.5 Phagen146

6.6 Phagemide147

6.7 Shuttle-Vektoren147

6.8 Künstliche Chromosome: YACs, BACs und PACs148

6.9 Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem149

6.9.1 Hefe als Modellorganismus149

6.9.2 Vektoren für Hefe151

6.9.3 Transformation von Hefe152

6.10 Pflanzen als Bioreaktoren152

6.10.1 Die Transformation von Pflanzen153

6.10.2 Transiente Transformationsverfahren155

6.11 Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen156

6.11.1 Säugetiere als Modellorganismen156

6.11.2 Säuger-Zellkulturen157

6.11.3 Vektoren für tierische Zellen158

6.11.4 Transfektion tierischer Zellkulturen159

7 Elektrophorese und Hybridisierung von Nukleinsäuren

7.1 Agarose-Gelelektrophorese von DNA162

7.2. Die Detektion der DNA im Gel167

7.3 Präparative Agarosegele169

7.4 Auftrennen von RNA im Agarosegel170

7.5 Fehlersuche bei Agarose-Gelelektrophorese170

7.6 Hybridisierung von Nukleinsäuren171

7.6.1 Southern und Northern Blot173

7.6.2 Herstellung der Sonde und Hybridisierung174

7.7 Microarrays174

8 Fortgeschrittene Klonierung

8.1 Klonsammlungen und synthetische Gene179

8.1.1 Klonsammlungen180

8.1.2 Synthetische Gene und Genfragmente180

8.2 Rekombinase-basierte Klonierung181

8.3 Mutageneseverfahren183

8.4 PCR-basierte Klonierungsverfahren: RF-Cloning und oePCR186

8.5 Synthetische Biologie188

8.6 Biobricks189

8.7 Nahtlose Klonierungsverfahren189

8.7.1 Golden Gate Klonierung190

8.7.2 Cut-Ligation Verfahren191

8.7.3 Multiple Insertionen mittels Golden Gate Klonierung192

8.7.4 Golden Gate basierte Tool Kits am Beispiel des MoClo Kits192

8.8 Gibson Assembly195

8.9 Vergleich der Verfahren198

9 Proteinaufreinigung

9.1 Homogenisation203

9.1.1 Proteasen204

9.1.2 Phenoloxidasen206

9.2 Extraktion von Proteinen207

9.2.1 Homogenisationspuffer207

9.2.2 Abtrennen von Zell- und Gewebetrümmern208

9.2.3 Fraktionierung des Rohextrakts208

9.3 Dialyse und Konzentrierung211

9.4 Weitere Aufreinigungsschritte212

9.4.1 Chromatographie213

9.4.2 Chromatographische Trennprinzipien215

9.4.3 Magnetic Beads216

9.5 Quantifizierung von Proteinen217

9.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford217

9.5.2 BCA-Test219

9.5.3 Welchen Test benutzen? 220

9.6 Aufreinigungsverfahren für getaggte Proteine aus E. coli221

9.6.1 Bakterienanzucht und Homogenisation 222

9.6.2 Weitere Aufreinigung des heterologen Proteins 224

10 Gelelektrophorese von Proteinen

10.1 Die Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)229

10.2 Die denaturierende SDS-PAGE229

10.2.1 Herstellung eines Proteinextrakts für die SDS-Gelelektrophorese229

10.2.2 Herstellen des Gels232

10.2.3 Der Gellauf235

10.3 Das Färben der Gele237

10.4 Weitere Elektrophoreseverfahren für Proteine239

10.4.1 Native PAGE239

10.4.2 Isoelektrische Fokussierung239

10.4.3 2-D-Gelelektrophorese 239

10.5 Western Blotting241

10.6 MassenspektrometrischeVerfahren246

11 Immunbiochemische Methoden

11.1 Antikörper251

11.2 Prinzipien immunbiochemischer Verfahren254

11.2.1 Immunpräzipitation254

11.2.2 Trägerbasierte Immunfärbung256

11.2.3 Immobilisierung des Antigens257

11.2.4 Blocken überschüssiger Bindestellen257

11.2.5 Detektion der Bindung257

11.2.6 Antikörper-Kaskaden259

11.2.7 Spezifische und unspezifische Bindungen260

11.3 ELISA261

11.3.1 Sandwich-ELISA 263

11.3.2 Kompetitiver ELISA265

11.4 Immunfärbung nach Western Blot266

11.5 Immunaffinitätschromatographie269

11.6 Weitere Antikörperbasierte Methoden270

11.6.1 Rekombinante Antikörper270

11.6.2 Phage Display und scFv271

11.6.3 Immunhistochemische Verfahren273

11.6.4 Markierung von Zellen274

12 Fortgeschrittene Verfahren

12.1 DNA-Sequenzierung278

12.1.1 Sequenzierung nach Sanger278

12.1.2 Herstellen von Proben für die DNA-Sequenzierung280

12.2 Next Generation Sequenzierung281

12.3 Von den „Omics“ zur Systembiologie285

12.4 Analyse der Genfunktion286

12.4.1 Reverse Genetik und Gene Targeting286

12.4.2 RNAi287

12.4.3 Durchführung von siRNA-Experimenten288

12.5 Genom Editierung289

13 Bioinformatik

13.1 Datenbanken296

13.2 Dateiformate298

13.3 Sequenzsuche anhand von Stichwörtern (Entrez)300

13.4 Sequenzsuche mit einer Sequenz (BLAST)300

13.5 Bioinformatik zur Planung der Laborarbeit305

14 Anhang

A1 Sicherheit im Labor308

A2 Die 10 goldenen Laborregeln309

A3 Das Laborbuch und die finale Arbeit311

Verzeichnis der „Gut zu wissen“-Boxen313

Abbildungsverzeichnis314

Verzeichnis der Maps316

Verzeichnis der Protokolle316

Tabellenverzeichnis317

Abkürzungsverzeichnis318

Sachverzeichnis321

Quellenverzeichnis328