Molekularbiologische Methoden

Dr. Thomas Reinard lehrt an der Leibniz Universität Hannover. 

Vorwort 7

1 Das Leben und seine Bestandteile 11

1.1 Der Aufbau von DNA und RNA 13

1.2 Der genetische Code 16

1.3 Die Gene 17

1.4 Die Proteine 22

1.5 Die Zelle 27

2 Grundlagen der Arbeit im Labor 29

2.1 Wasser 30

2.2 Messung des pH-Wertes 31

2.3 Puffer 32

2.4 Waagen 33

2.5 Mikropipetten 34

2.6 Gefäße im Labor 36

2.7 Zentrifugen 36

2.8 Mischen und Konzentrieren 40

2.9 Konzentrieren 41

2.10 Pufferwechsel 42

2.11 Proben-Lagerung 42

2.12 Steriles Arbeiten 43

2.13 Die kleinen Freunde – Pflege und Aufzucht von Escherichia coli 45

2.14 Der Aufschluss von Geweben 50

3 Aufreinigung von Nukleinsäuren 53

3.1 Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen 55

3.2 Extraktion von Nukleinsäuren 58

3.3 Die weitere Aufreinigung der DNA 59

3.4 Einige ausgewählte DNA-Aufreinigungsmethoden 66

3.5 Die Isolation von RNA 71

3.6 Übersicht über den Einsatz von Kits 74

3.7 Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren74

3.8 Quantifizierung von Nukleinsäuren 75

4 Polymerase Kettenreaktion 79

4.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion 81

4.2 Die Komponenten der PCR 81

4.3 Geräte für die PCR 90

4.4 Die Standard-PCR 91

4.5 Ausgewählte PCR-Methoden 91

4.6 Anwendungen der PCR 100

4.7 Optimierung der PCR-Reaktion 101

5 Klonieren für Einsteiger 103

5.1 Restriktionsenzyme 105

5.2 Ligation 113

5.3 Dephosphorylierung 115

5.4 Die Transformation von E. coli 117

5.5 Der Weg zum klonierten Gen 119

5.6 Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor 119

5.7 Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor 122

5.8 Ligase-unabhängige Klonierungssysteme 124

5.9 Wenn es mal nicht klappt 125

6 Vektoren 127

6.1 Plasmide 129

6.2 Klonierungsplasmide 132

6.3 Rekombinase-basierte Klonierung 136

6.4 Expressionsplasmide 139

6.5 Reportergene 143

6.6 Phagen 146

6.7 Phagemide 147

6.8 Shuttle-Vektoren 147

6.9 Künstliche Chromosomen: BACs, PACs und YACs 148

6.10 Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem 149

6.11 Die Transformation von Pflanzen 151

6.12 Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen 153

7 Elektrophorese vonNukleinsäuren 157

7.1 Agarose-Gelelektrophorese von DNA 159

7.2 Die Detektion der DNA im Gel 164

7.3 Präparative Agarosegele 165

7.4 Auftrennen von RNA im Agarosegel 167

7.5 Fehlersuche bei der Agarose- Gelelektrophorese 168

8 Proteinaufreinigung 171

8.1 Homogenisation 175

8.2 Extraktion von Proteinen 177

8.3 Dialyse und Konzentrierung 181

8.4 Weitere Aufreinigungsschritte 183

8.5 Quantifizierung von Proteinen 186

8.6 Aufreinigungsverfahren für getaggte Proteine aus E. coli 189

9 Gelelektrophorese von Proteinen 195

9.1 Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 197

9.2 Die denaturierende SDS-PAGE 197

9.3 Das Färben der Gele 206

9.4 Weitere Elektrophoreseverfahren für Proteine 208

9.5 Western Blotting 211

9.6 Wenn es mal nicht klappt 214

10 Immunbiochemische Methoden 217

10.1 Antikörper 219

10.2 Prinzipien immunbiochemischer Verfahren 223

10.3 Spezifische und unspezifische Bindungen 229

10.4 Immunbiochemische Verfahren 230

10.5 ELISA 230

10.6 Immunfärbung nach Western Blot 235

10.7 Immunoaffinitätschromatographie 237

10.8 Weitere Antikörper-basierte Methoden 239

10.9 Wenn es mal nicht klappt 240

11 Molekularbiologie für Fortgeschrittene 243

11.1 DNA-Sequenzierung 245

11.2 Bioinformatische Sequenzanalyse 248

11.3 Der Einsatz der Bioinformatik für die Klonierung von DNA 250

11.4 Vollständige Sequenzen durch 3‘ RACE-PCR und 5‘ RACE-PCR 251

11.5 Stammsammlungen 253

11.6 Identifizierung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung 253

11.7 DNA-Chips oder Microarrays 255

11.8 Veränderung von Nukleinsäuren 256

11.9 Synthetische Gene 260

Anhang

A1 Sicherheit im Labor 262

A2 Die 10 goldenen Laborregeln 263

A3 Das Laborbuch und die finale Arbeit 264

Verzeichnis der Maps, Protokolle, E-Docs, Tabellen und Abbildungen 266

Abkürzungsverzeichnis 268

Quellenverzeichnis 268

Register 269