Untersuchungen zur Überlebensfähigkeit von Escherichia coli O104:H4 sowie der Stabilität der spezifischen Virulenzeigenschaften Verotoxin 2a und AAF/I im Teewurst-Modell

Für das schwere Ausmaß eines Ausbruchsgeschehens durch den Hybridklon EAHEC (enterohämorrhagisch-aggregative E. coli) O104:H4 in 2011 konnte maßgeblich eine Kombination aus zwei Virulenzfaktoren, nämlich Vtx2 und AAF/I, verantwortlich gemacht werden. Das Gen für die Bildung des Verotoxin 2a ist über Bakteriophagen übertragbar. Die genetische Information für die AAF/I-Fimbrie, die zur sog. aggregativen Adhärenz führt, ist auf einem Virulenzplasmid lokalisiert, das gleichfalls mobil ausgetauscht werden kann.
Bisher lagen keine Informationen zur Überlebensfähigkeit des Erregers bzw. auch zur Stabilität der zuvor genannten Virulenzfaktoren in kurzgereiften Rohwürsten vor. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wachstumsverhalten und die Stabilität des Verotoxin-Bildungsvermögens und der Fähigkeit zur Ausbildung der aggregativen Adhärenz des Ausbruchsstammes in Teewurst, einem national sehr beliebten Lebensmittel, zu untersuchen.
In 22 Versuchsreihen wurde der EAHEC O104:H4-Ausbruchsstamm während des Herstellungsprozesses in einer Größenordnung von 1,0 x 103 KbE/25 g in Teewurst-Kuttermasse eingemischt. Die artifiziell kontaminierten Teewürste wurden an den Tagen 0, 2, 7 und 14 quantitativ auf EAHEC O104:H4 untersucht, wobei der Ausstrich direkt auf ESBL Brilliance™-Agar erfolgte. Mitternachtsblaue Kolonien wurden als positiv angesprochen. Parallel wurde je Versuchsdurchlauf eine negative Kontrollcharge produziert und qualitativ untersucht. Für die qualitative Untersuchung wurde nach einer 6 h-Anreicherung in BRILA (Brillantgrün-Galle-Laktose)-Bouillon auf das Selektivnährmedium ausgestrichen. Präsumtives Koloniematerial wurde je Versuchsansatz und Untersuchungstag in einer Multiplex-PCR auf das Vorhandensein der spezifischen Gensequenzen vtx2, TerD, rfb O104 und fliC H4 getestet. Dadurch konnte zum einen abgesichert werden, dass es sich um den Zielorganismus handelt, zum anderen ergab sich hieraus eine Aussage über die Stabilität des Verotoxin-Bildungsvermögens. Für die Untersuchung auf die Fähigkeit zur aggregativen Adhärenz wurden die spezifischen Genloci AggA und AggC des pAA-Plasmids ausgewählt und hierfür eine konventionelle Duplex-PCR entwickelt.
In allen Proben konnte zu jedem Untersuchungszeitpunkt EAHEC O104:H4 nachgewiesen werden. Sämtliche Reisolate konnten in der PCR positiv auf die typischen Gensequenzen für vtx2, TerD, rfb O104, fliC H4, aggA und aggC getestet werden.

In der vorliegenden Arbeit erwies sich der EAHEC O104:H4-Ausbruchsstamm im Teewurst-Modell während des gesamten Haltbarkeitszeitraumes als überlebensfähig. Zudem waren die genetischen Informationen zur Ausbildung der Haupt-Virulenzfaktoren Vtx2a und AAF/I weiterhin vorhanden. Dies belegt, dass diese genetischen Elemente in dieser Lebensmittel-Matrix stabil bleiben.
Lebensmittel, die wie die Teewurst zum Verzehr in rohem Zustand bestimmt sind, sind allein dadurch risikobehaftet, Auslöser von Lebensmittelinfektionen sein zu können. Dies ist insbesondere für Mitglieder der YOPIS relevant. Die vorliegende Arbeit konnte keinen Beleg liefern, dass eine Kontamination von EAHEC O104:H4 in Teewurst zu einer verminderten Virulenz dieses Pathogens führen würde. Im Falle einer Kontamination ist das Risiko für den Verbraucher daher als hoch einzuschätzen, sich durch den Verzehr von Teewurst mit EAHEC O104:H4 zu infizieren. A combination of the two virulence factors Vtx2 and AAF/I was found to be most responsible for the severity of a 2011 outbreak of EAHEC (enteroaggregative-haemorrhagic E. coli) O104:H4, a hybrid clone of EHEC and EAEC. Genes that encode the acquirement to produce Verotoxin 2a are transferable by a bacteriophage. The genetic information for the AAF/I-fimbria, which leads to so-called aggregative adherence, is located on a virulence plasmid. Plasmids are shown to be easily interchanged within strains of E. coli.
To date no information was found about the survival or the stability of the mentioned virulence factors in shortly fermented raw sausages. The objectives were to examine the stability of the acquirement to produce verotoxin-2 and AAF/I-fimbria and the growth behavior of the outbreak strain in Teewurst, a typical German raw and spreadable sausage.
22 equal test series took place, in which the EAHEC O104:H4 -outbreak strain was inoculated into the Teewurst-batter with 1.0 x 103 cfu per 25 grams. The contaminated sausages then were examined by quantity for the presence of EAHEC O104:H4 on days 0, 2, 7, and 14. The dilutions were plated directly on Brilliance™ ESBL without previous enrichment, to show midnight-blue colonies. During any cycle, a negative trial was performed, including a parallel production and qualitative analysis. After an incubation of 6h in BRILA (brilliant-green bile lactose), the broth was plated on ESBL. Colony material from each trial was tested for the specific gene sequences vtx2, TerD, rfb O104 and fliC H4 in a multiplex PCR to ensure the presence of the target organism and to show the capability to produce verotoxin. A duplex PCR for aggA and aggC, both placed on the plasmid pAA, was established to identify the ability to build AAF/I.
EAHEC O104:H4 could be detected on each examination day and in each trial. Each reisolated DNA was tested positive for vtx2, TerD, rfb O104, fliC H4, aggA and aggC.
In this study the EAHEC O104:H4 -outbreak strain has been shown to survive in a Teewurst-model during the whole shelf life. Furthermore, the genetic information to build the main virulence factors, VTX2a and AAF/I, seems to remain stable in this food matrix.
The risk of causing a foodborne disease is given if the food is meant to be consumed in a raw state like in the case of Teewurst, which is relevant especially for members of YOPIS. This study did not find any proof that a contamination with EAHEC O104:H4 in Teewurst would result in a reduced virulence of this pathogen. The estimated risk of an infection with EAHEC O104:H4 by consuming contaminated Teewurst is stated to be high.