Die Linalool-Dehydratase-Isomerase aus dem nitratreduzierenden Betaproteobakterium Castellaniella defragrans 65Phen

Monoterpene finden in der Volksmedizin seit langem Anwendung. Beispielsweise enthal-ten Hustenbonbons oft Menthol oder Eukalyptol. Die heilende Wirkung dieser Monoterpenoide, oft im Gemisch mit anderen Monoterpenen (ätherischen Ölen), wird den antibiotischen Eigenschaften dieser Naturstoffe zugeschrieben. Pflanzen synthetisieren Monoterpene in großer Menge: als Fraßschutz, als Botenstoff zwischen Pflanzen und als Verdunstungsschutz. Allein 127 Millionen Tonnen werden jährlich in die Atmosphäre ab-gegeben. Von dem Metabolismus der Monoterpene im Boden ist bislang nur wenig be-kannt: So tragen Monoterpene im Nadelstreu zur schnellen Ausbreitung von Waldbränden bei (dort befinden sich mehr als ein Liter Monoterpene pro Quadratmeter). Seit einigen Jahren wird der Abbau von Monoterpenen durch anaerobe, Nitrat-atmende Bakterien und methanogene Anreicherungskulturen erforscht. Eines der denitrifizierenden Bakterien stellt Castellaniella (ex Alcaligenes) defragrans 65Phen dar. Dieser Organismus minerali-siert Monoterpene in der Abwesenheit von molekularem Sauerstoff. Unter Nitrat-reduzierenden Bedingungen werden diese Kohlenwasserstoffe komplett zu Kohlenstoffdioxid oxidiert. In dieser Arbeit wurden die Enzymaktivitäten der Geraniol-Isomerase und der Linalool-Dehydratase gereinigt und enzymatisch charakterisiert. In einem fünfstufigen Reinigungsprotokoll wurde die Linalool-Dehydratase zur Homogenität gereinigt. Das Protein katalysierte darüber hinaus die Isomerisierung von Geraniol zu Linalool. Auch die thermodynamisch nicht begünstigten Rückreaktionen von Myrcen zu Linalool und von Linalool zu Geraniol waren messbar. Als Name für das neue Enzym wird daher Linalool-Dehydratase-Isomerase vorgeschlagen. Es verfügt über ein natives Mole-kulargewicht von 160 kDa und ist ein Tetramer aus einem 40 kDa-Protein. Chirale Gaschromatographie-Analysen zeigten die enantiomerselektive Isomerisierung von Gera-niol über (S)-(+)-Linalool zu Myrcen, mit einem Enantiomerüberschuss von ≥99%. Thauera linaloolentis 47Lol hatte eine Geraniol-Isomerase-Aktivität zu (R,S)-Linalool, Thauera terpenica 58Eu eine Geraniol-Dehydratase-Aktivität zu Myrcen. Das Gen der Linalool-Dehydratase-Isomerase wurde mittels N-terminaler Proteinsequenzierung in einer vorhandenen Fosmidsequenz von C. defragrans identifiziert. Die Gensequenz kodiert für ein Präprotein mit 397 Aminosäuren inklusive einem N-terminalen Signalpeptid für eine Sec-abhängige Translokation ins Periplasma. Die Linalool-Dehydratase-Isomerase ist das erste Protein einer neuen Proteinfamilie.

Description
Only a few of over 30 000 isoprenoic compounds have served as single carbon source in the isolation of anaerobic bacteria. Monoterpenes, which consitst of two isoprene subunits, yielded denitrifying bacteria belonging to the genus of Castellaniella and Thauera. The characterization of the special biochemistry of isoprenoid mineralization in these organisms has started.
In general, monoterpenes are volatile organic compounds of plants and are a significant part of the global carbon cycle. The monoterpenes are well known as constituents of es-sential oils, e.g. pinene. Below toxic concentrations, the compounds may be mineralized by denitrifying microorganisms, like the monoterpene-degrading Betaproteobacterium Castellaniella defragrans. Initial metabolite studies have revealed the microbial capacity to transform monoterpenes and geranic acid has been identified as first ionic metabolite. Oxygenated monoterpenes are in general more toxic than non-functionalized monoter-penes due to the reactivity especially of the ketone and aldehyde groups. However, Thauera terpenica and Thauera linaloolentis could be isolated and initial studies revealed with an allylalcohol isomerase a novel enzyme activity. Here we report the characterization of linalool dehydratase-isomerase which catalyzes the allylalcohol linalool (3,7-Dimethyl-1,6-octadien-3-ol) to geraniol and the dehydration of linalool to myrcene in vitro. The en-zyme was purified from Castellaniella (ex: Alcaligenes) defragrans to homogeneity. The isolation of the linalool dehydratase was achieved by anion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography and size exclusion chromatography. The corre-sponding gene was identified and bioinformatic analysis revealed no relation with known enzymes. There is no special need for any cofactors, but experiments show a stimulating effect of coenzyme B12. Amino acid analyzes revealed the existence of a leader sequence for a Sec-dependent membrane translocation mechanism. The precursor protein seems to exhibit a much lower enzyme activity than the mature protein. The linalool dehydratase-isomerase seems to build a new protein family.