Über den Effekt von intraneural applizierten miR-1-mimetischen Nukleotiden auf induzierten chronischen neuropathischen Schmerz bei der Ratte

Sowohl in der Humanmedizin als auch in der Tiermedizin spielt Schmerz bzw. die Behandlung von Schmerzen eine ernstzunehmende Rolle. Insbesondere chronische neuropathische Schmerzen stellen behandelnde Ärzte vor große Herausforderungen. Es scheint, dass mikro RNAs (miRs) und insbesondere mikro RNA-1 (miR-1) eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und Entwicklung von chronischen neuropathischen Schmerzen spielen. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits einen Zusammenhang zwischen der Reduktion der miR-1-Expression in Nervengewebe und der Induktion von brain derived neurotrophic factor (BDNF) und Connexin 43 (Cx43) nachweisen. Sowohl BDNF als auch Cx43 stehen in engem Zusammenhang mit der Entstehung und Aufrechterhaltung chronischer Schmerzustände. Daraus ergab sich die Hypothese, dass miR-1-mimetische Nukleotide (miR-1-Mimic) durch chronic constriction injury (CCI) verursachte neuropathische Schmerzen bei Ratten lindern.
Zuerst wurde das miR-1-Mimic in Bezug auf Effektivität, Funktionalität und intrazelluläre Stabilität mithilfe eines Transfektionsversuchs an humanen Glioblastomzellen (U-87 MG) getestet. Die transfizierten Zellen wurden 48 h und 96 h nach Transfektion mittels qRT-PCR bzw. Western Blot untersucht, um das Expressionsniveau von miR-1 bzw. die relative Expression von Cx43 zu messen (n = 3). Als Kontrollgruppe dienten U-87 MG-Zellen, welche auf gleiche Weise mit einer nicht codierenden Version des Moleküls mit gleichen chemischen Eigenschaften (scrambled miR-1-Mimics) transfiziert wurden (n = 3).
Nach Erteilung der Genehmigung zur Durchführung von Tierversuchen durch die zuständige Behörde, wurde das miR-1-Mimic in vivo an männlichen Wistar Ratten eingesetzt. Zur Induktion einer chronischen peripheren Mononeuropathie des linken Nervus ischiadicus wurden die Tiere einer CCI-Operation unterzogen. Anschließend erfolgte eine Unterteilung der Tiere in zwei Gruppen. Tiere der ersten Gruppe erhielten dreimalig eine intraneurale Injektion mit miR-1-Mimics (Tag 0, 3 und 7) in den linken Nervus ischiadicus (n=6). Die Kontrollgruppe wurde entsprechend mit scrambled miR-1-Mimics behandelt (n=6). Die Messung der Allodynie als Zeichen der Ausbildung und Schwere einer Neuropathie erfolgte mittels Dynamic plantar Aesthesiometer® bei beiden Gruppen an der linken Hinterpfote am zehnten postoperativen Tag. Anschließend wurden alle Tiere euthanasiert, sodass ihnen ein Teilstück des N. ischiadicus der linken Seite sowie die zugehörigen Dorsalganglien (L4 bis L6) entnommen werden konnten. Das gewonnene Nervengewebe wurde mittels qRT-PCR bzw. Western Blot untersucht, um das Expressionsniveau von miR-1 bzw. die relative Expression von Cx43 zu messen.
Unterschiede zwischen den Tiergruppen wurden mithilfe des Student's t-Test und der Bonferroni-Holms-Korrektur verglichen. Die in vitro-Experimente wurden in Triplikaten durchgeführt. Ein p-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied gewertet.
Im Transfektionsversuch zeigte sich nach 48 h und 96 h im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikant höheres Expressionsniveau von miR-1 in U-87-MG-Zellen, die mit miR-1-Mimics behandelt worden waren. Parallel dazu ergaben sich für die relative Expression von Cx43 in mit miR-1-Mimics behandelten U-87-MG-Zellen zu beiden Zeitpunkten signifikant niedrigere Werte als in der Kontrollgruppe.
In vivo ergab die qRT-PCR eine signifikant höhere miR-1-Expression im Nervengewebe (N. ischiadicus) der mit miR-1-Mimics behandelten Tiere gegenüber den Kontrolltieren. In den Dorsalganglien zeigten sich dagegen keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der miR-1-Expression zwischen den Gruppen. Die Untersuchung des Nervengewebes (N. ischiadicus) durch eine Western Blot-Analyse zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen in Bezug auf die relative Expression von Cx43. Der als Maß für die mechanische Allodynie bestimmte Pfotenrückzugsschwellenwert (paw withdrawal threshold) zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen.
Im Transfektionsversuch konnte gezeigt werden, dass miR-1-Mimics effektiv, funktional und intrazellulär stabil sind, da sie die Cx43 Expression längerfristig und wirksam reduzieren konnten. Ein ähnliches Ergebnis konnte am lebenden Organismus mit dem hier angewendeten Versuchsaufbau jedoch nicht erreicht werden. Auch eine Linderung neuropathischer Schmerzen konnte nicht erzielt werden.
Indessen bleibt miR-1 ein vielversprechender Kandidat für die Therapie neuropathischer Schmerzen und ein interessanter Gegenstand für zukünftige Forschungsarbeiten.
Pain or the treatment of pain plays a serious role in both human and veterinary medicine. In particular, chronic neuropathic pain poses great challenges to treating physicians. Studies suggest that micro RNAs (miRs), and especially micro RNA-1 (miR-1), play a key role in the onset and development of chronic neuropathic pain. Our group has previously demonstrated a link between the reduction of miR-1 expression in neural tissue and the induction of brain derived neurotrophic factor (BDNF) and connexin 43 (Cx43). Both BDNF and Cx43 are closely related to the development and maintenance of chronic pain conditions. This led to the hypothesis that miR-1-mimetic nucleotides (miR-1-mimic) alleviate chronic constriction injury (CCI)-induced neuropathic pain in rats.
Firstly, the miR-1-mimic was tested for efficacy, functionality and intracellular stability using a transfection experiment on human glioblastoma cells (U-87 MG). The transfected cells were analyzed 48 h and 96 h after transfection by qRT-PCR and Western blot to determine the expression level of miR-1 and the relative expression of Cx43 (n = 3). U-87 MG cells transfected in the same manner with a noncoding version of the molecule with the same chemical properties (scrambled miR-1 mimics) served as control group (n = 3).
After obtaining permission from the responsible authority to perform animal experiments, the miR-1 mimic was used in vivo in male Wistar rats. To induce chronic peripheral mononeuropathy of the left sciatic nerve, animals underwent CCI surgery. Subsequently, the animals were divided into two groups. Animals in the first group received an intraneural injection with miR-1 mimics three times (day 0, 3, and 7) into the left sciatic nerve (n=6). The control group was treated accordingly with scrambled miR-1 mimics (n=6). Measurement of allodynia as a sign of the development and severity of neuropathy was performed using Dynamic plantar Aesthesiometer® in both groups on the left hind paw on the tenth post-operative day. Subsequently, all animals were euthanized so that a section of the sciatic nerve of the left side, and the associated dorsal ganglia (L4 to L6), could be removed from them. The obtained neural tissue was analyzed by qRT-PCR or Western blot to measure the expression level of miR-1 and the relative expression of Cx43.

Differences between animal groups were compared using Student's t-test and Bonferroni-Holms-correction. In vitro experiments were performed in triplicates. A p value of < 0.05 was considered statistically significant.
In the transfection experiment, there was a significantly higher expression level of miR-1 in U-87-MG cells treated with miR-1 mimics after 48 h and 96 h compared to the control group. In parallel, the relative expression of Cx43 in U-87-MG cells treated with miR-1 mimics was significantly lower than the control group at both time points.
In vivo, qRT-PCR revealed significantly higher miR-1 expression in the neural tissue (sciatic nerve) of animals treated with miR-1 mimics compared to control animals. In contrast, there were no significant differences in miR-1 expression between the groups in the dorsal ganglia. Examination of neural tissue (sciatic nerve) by Western blot analysis revealed no statistically significant differences between groups in relative expression of Cx43. Furthermore, the paw withdrawal threshold determined as a measure of mechanical allodynia showed no significant difference between the two groups.
In the transfection experiment, miR-1 mimics were shown to be effective, functional, and intracellularly stable, as they were able to reduce Cx43 expression in a prolonged and effective manner. However, a similar result could not be achieved in the living organism with the experimental set up outlined here. Nor was relief of neuropathic pain achieved.
Nonetheless, miR-1 remains a promising candidate for the therapy of neuropathic pain and an interesting subject for future research.