Charakterisierung equiner multipotenter mesenchymaler Stammzellen aus Fettgewebe und Untersuchung des kardiomyogenen Differenzierungspotentials

Adulte, multipotente mesenchymale Stammzellen (MSCs) stellen nicht nur für die regenerative Medizin, sondern auch für die Etablierung von in-vitro-Modellen einen wichtigen Forschungsschwerpunkt dar. MSCs aus Fettgewebe (ASCs) eignen sich hierfür besonders und haben das Potential, in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, darunter in Kardiomyozyten-ähnliche Zellen (CLCs), wie in Studien bei Menschen, Kaninchen und Nagern beschrieben wurde.

Ziel der Untersuchungen war es, (1) die mittels zwei Isolierungsverfahren aus unterschiedlichen Fettgewebelokalisationen gewonnenen MSCs hinsichtlich ihrer in-vitro-Charakteristika zu vergleichen. Im zweiten Teil der Studie (2) sollte das kardiomyogene Differenzierungspotential der Zellen erstmals beim Pferd in vitro untersucht werden, um das Grundlagenwissen in Bezug auf die Etablierung eines pferdespezifischen in-vitro-Kardiomyozytenmodells zu erweitern.

In die in-vitro-Studie wurden n = 16 Pferde einbezogen, von denen post mortem MSCs aus abdominalem (abd), retrobulbärem (rb) und subkutanem (sc) Fettgewebe mittels des Explantat-Verfahrens (ASCs-EXP) und nach Kollagenaseverdau (ASCs-SVF) gewonnen wurden. Nach Evaluierung des Isolierungserfolgs (n = 16), des Proliferationspotentials (n = 3) sowie des für das Zellwachstum am besten geeigneten Serumsupplements (n = 3) wurden die Zellen auf ihre Charakteristika als MSCs überprüft, wozu die Fähigkeit zur Plastikadhärenz, die Untersuchung des tripotenten Differenzierungspotentials über 7, 14 bzw. 21 Tage (n = 6) und das spezifische Oberflächenmarkerprofil (n = 5) zählten. Es folgte die Untersuchung des kardiomyogenen Differenzierungspotentials von abd-ASCs-SVF (n = 5) mithilfe des Induktionsfaktors 5-Azacytidin (5-AZA) sowie der Faktoren Activin A (Act A), knochenmorphogenetisches Protein-4 (BMP-4) und Dickkopf-1 (DKK-1). Eine Untersuchung zellmorphologischer Veränderungen sowie Analyse der Expression kardialer und pluripotenzassoziierter Marker sowie eines Muskelmarkers mittels SYBR Green RT-qPCR wurden an Tag 0 (T0) und 3 Wochen nach Induktion (T3) angeschlossen.

Plastikadhärente, Fibroblasten-ähnliche ASCs-EXP und ASCs-SVF konnten aus abd-, rb- und sc-Fettgewebe gewonnen werden. Während sich abd- und rb-ASCs hinsichtlich des Isolierungserfolgs annähernd gleich verhielten, wiesen sc-ASCs einen signifikant niedrigeren Isolierungserfolg auf. In Bezug auf die Zellproliferation wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Lokalisationen und Isolationsmethoden festgestellt, jedoch ein signifikanter Effekt des Serumsupplements. Das höchste adipogene Differenzierungspotential wiesen abd-ASCs-EXP gegenüber rb- und sc-ASCs-EXP an Tag 7 und abd-ASCs-SVF gegenüber abd-ASCs-EXP an Tag 14 auf. Das osteogene Differenzierungspotential erwies sich an Tag 14 zwischen ASCs der verschiedenen Lokalisationen und Isolierungsverfahren annähernd gleich. An Tag 21 wiesen abd-ASCs-EXP gegenüber abd-ASCs-SVF und rb-ASCs-EXP ein höheres osteogenes Differenzierungspotential auf. Das chondrogene Differenzierungspotential war bei allen Zellen unabhängig von der Gewebequelle und Isolationsmethode vergleichbar. Die untersuchten Zellen waren positiv für CD29, CD44, CD90 sowie negativ für CD34 und CD45 und exprimierten die pluripotenzassoziierten Marker OCT4/POUF5, MYC und DNMT3B. Eine kardiomyogene Differenzierung konnte weder mithilfe von 5-AZA noch mithilfe unterschiedlicher Konzentrationen von Act A, BMP-4 und DKK-1 nachgewiesen werden. Es wurden weder zellmorphologische Veränderungen, eine spontane Schlagaktivität noch eine Aufregulierung der kardialen Marker NKX2-5, GATA4, TNNI3, MYH6, MYH7 sowie des Muskelmarkers MYF6 zum Zeitpunkt T3 im Vergleich zu den Positivkontrollen mittels SYBR Green RT-qPCR nachgewiesen.

Die vorliegende Studie vergleicht die mittels der beiden Isolierungsverfahren aus den drei Fettgewebelokalisationen isolierten equinen MSCs in Bezug auf ihre Charakteristika in vitro, wobei eine Isolierung equiner rb-ASCs zuvor noch nicht beschrieben wurde. Auch wenn eine kardiomyogene Differenzierung von MSCs bei verschiedenen Spezies in vitro nachgewiesen wurde, lagen hierzu bisher keine Studien zum Pferd vor. In der vorliegenden Studie wird erstmals der Effekt des in der Literatur am häufigsten eingesetzten kardiomyogenen Induktors 5-AZA sowie der an der embryonalen Kardiomyogenese beteiligten Faktoren Act A, BMP-4 und DKK-1 untersucht.

Es konnte gezeigt werden, dass equine ASCs-EXP und ASCs-SVF aus allen untersuchten Fettgewebelokalisationen gewonnen und aufgrund ihrer Charakteristika eindeutig als MSCs identifiziert werden konnten. Die Zellen wiesen ein hohes Proliferations- und tripotentes Differenzierungspotential auf. Eine kardiomyogene Differenzierung equiner abd-ASCs-SVF konnte allerdings unter Einsatz der gewählten Induktionsfaktoren und Versuchsbedingungen nicht erreicht werden. Die vorliegende Studie trägt dazu bei, das Grundlagenwissen über die in-vitro-Charakteristika equiner ASCs zu erweitern. Weitere Vergleichsstudien, in denen der Einfluss der Isolationsmethode auf equine MSCs verschiedener Herkünfte überprüft wird, sind anzuraten. In Bezug auf die kardiomyogenen Differenzierungsversuche ist der Einsatz pluripotenter Stammzellen anstelle der multipotenten MSCs in Erwägung zu ziehen, da diese ein höheres Differenzierungspotential aufweisen. "Characterisation of equine multipotent mesenchymal stem cells from adipose tissue and investigation of cardiomyogenic differentiation potential"

Adult multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) represent an important research focus not only for regenerative medicine, but also for the establishment of in vitro models. For this, especially MSCs from adipose tissue (ASCs) are suitable. ASCs have the potential to differentiate in vitro into different cell types, including cardiomyocyte-like cells (CLCs), as could be demonstrated in studies for humans, rabbits and rodents.

The study´s aims were (1) to obtain MSCs from distinct equine adipose tissue localizations using two isolation procedures and compare their in vitro characteristics. In addition, (2) cardiomyogenic differentiation potential of the cells should be investigated, in order to expand the basic knowledge regarding the development of an equine-specific in vitro cardiomyocyte model.

The in vitro study included n = 16 horses. MSCs from abdominal (abd), retrobulbar (rb) and subcutaneous (sc) adipose tissue were isolated by explant technique (ASCs-EXP) and collagenase digestion (ASCs-SVF). The isolation success (n = 16), proliferation potential (n = 3) and serum supplement most suited for cell growth (n = 3) were investigated. Furthermore, cells were examined for MSCs characteristics by investigating the ability to plastic adherence, trilineage differentiation potential for 7, 14 or 21 days (n = 6) and specific surface marker profile (n = 5). This was followed by the examination of the cardiomyogenic differentiation potential of abd-ASCs-SVF (n = 5) by means of the induction factor 5-azacytidine (5-AZA) as well as the factors activin A (Act A), bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) and Dickkopf-1 (DKK-1). Investigation of cell morphologic changes and the expression of cardiac markers, pluripotency-associated markers and one muscle marker using SYBR Green RT-qPCR was carried out on day 0 (timepoint T0) and three weeks after induction (T3).

Plastic adherent, fibroblast-like ASCs-EXP and ASCs-SVF could be harvested from abd, rb and sc adipose tissue. The isolation success of abd- and rb-ASCs was nearly comparable, but significant lower in sc-ASCs. Regarding cell proliferation no significant differences between localizations and isolation techniques were demonstrated. However, a significant effect of the serum supplement was shown. Abd-ASCs-EXP presented the highest adipogenic differentiation potential compared with rb- and sc-ASCs-EXP on day 7 and abd-ASCs-SVF compared with abd-ASCs-EXP on day 14. The osteogenic differentiation potential was nearly comparable on day 14 regarding ASCs of different localizations and isolation procedures. However, on day 21 abd-ASCs-EXP showed a higher osteogenic differentiation potential compared to abd-ASCs-SVF and rb-ASCs-EXP. The chondrogenic differentiation potential was nearly comparable for all cells, independent of the tissue source and isolation procedure. The examined cells were positive for CD29, CD44, CD90 and negative for CD34 and CD45 and expressed the pluripotency associated markers OCT4/POUF5, MYC and DNMT3B. Cardiomyogenic differentiation could not be proved, neither by using 5-AZA nor different concentrations of Act A, BMP-4 and DKK-1. There were neither changes of cell morphology nor a spontaneous beating activity. An upregulation of the cardiac markers NKX2-5, GATA4, TNNI3, MYH6 and MYH7 as well as the muscle marker MYF6 on time point T3 compared to positive controls could not be demonstrated by means of SYBR Green RT-qPCR.

This study compared MSCs, which were harvested by the two isolation procedures from three adipose tissue localizations, regarding their in vitro characteristics, whereby isolation of equine rb-ASCs has not been published before. Although cardiomyogenic differentiation of MSCs has been demonstrated for different mammal species including humans, no studies have been available for equine MSCs until today. This is the first study that investigated the effect of the most frequently used cardiomyogenic induction factor 5-AZA as well as the factors Act A, BMP-4 and DKK-1 participating in embryonic cardiomyogenesis.

It was demonstrated, that equine ASCs-EXP and ASCs-SVF could be harvested from all examined adipose tissue sources and could be clearly identified as MSCs. Moreover, the cells showed a high proliferation and trilineage differentiation potential. However, a cardiomyogenic differentiation of equine abd-ASCs-SVF could not be reached by using the selected induction factors and experimental conditions. The present study contributes to expand the basic knowledge of in vitro characteristics of equine ASCs. More comparative studies are needed to further investigate the influence of the isolation technique of equine MSCs harvested by different sources. With regard to the cardiomyogenic induction experiments, the use of pluripotent stem cells instead of multipotent MSCs should be considered, because pluripotent stem cells have a higher differentiation potential.