Evaluierung und Etablierung von Analyseverfahren zur Differenzierung der Spezies V. cholerae Non-O1/-O139 und V. mimicus mittels MALDI-TOF MS in einem Routinelabor der amtlichen Lebensmittelüberwachung

Evaluation and establishment of analytical methods for the differentiation of the species V. cholerae Non-O1/-O139 and V. mimicus by means of MALDI-TOF MS in a routine laboratory of official food monitoring

The aim of this work was to differentiate the closely related species V. cholerae and V. mimicus quickly and reliably, using MALDI-TOF MS and the available standard softwares (flexAnalysis, MALDI Biotyper OC) and their tools. Later on it was possible to get an additional software (ClinPro Tools) and an extra Vibrio-specific database (VibrioBase) to also include them into the tests.
First, 20 (ten per species) of 62 Vibrio-Isolates were selected to examine them for potentially species-discriminating peaks in the flexAnalysis software. An internal calibration of the spectra to a genus common peak was profitably, because they were constistently lined up and scatter was minimized. Noticeable peaks had to pass the selection criteria to become evaluated as potentially species-discriminating. Then these peaks were validated using the previous 20 and another 42 isolates. A sensitivity of 97% and a specificity of 100% for V. cholerae were calculated and 93% and 97% for V. mimicus.
With the software tools of MALDI Biotyper OC no discriminating peaks could be detected. But the species could easily be distinguished with the dendrogram- and PCA-function, if control isolates were included. In parallel, spectra of the 42 above-mentioned isolates were created and compared using direct transfer (BRUKER DALTONIK GmbH, 2013b) and formic acid extraction (BRUKER DALTONIK GmbH, 2013a). It quickly became apparent that the direct transfer saves an important amount of work, resources and time.
Later it was discovered with the software ClinPro Tools that the previously found discriminating peaks were determined much faster. Especial using the function to generate your own models, in the future direct transfer could result in the possibility of obtaining a result for a questionable V. cholerae-mimicus isolate (from agar plate to result) within about 15 minutes. However, ClinPro Tools had the limitation, that spectra of the same isolates or of very closely related species, e.g. V. metoecus, were not noticed and could not be differentiated. With this problem, felxAnalysis turned out to be time-consuming, but because of the very precise spectrum analysis it turned out to be more suitable.
At a later point in time, eleven additional isolates were provided by the BfR, for which contrary species results have been obtained in previous examinations. These isolates were examined in the same way as the previous ones. In all three used softwares and their applications they got the result V. mimicus. This was later confirmed by the BfR via genome sequence analysis and it supports the applicability of the differentiation, used in this work, of closely related bacterial species by MALDI-TOF MS.
Finally, the VibrioBase database was added to MALDI Biotyper OC. The aim was totest, if it could be used to differentiate the investigated species better than the previously available databases (BDAL and SR). V. cholerae isolates were identified 100% correctly with both the VibrioBase (+ SR) and Bruker BDAL databases (+SR). V. mimicus isolates were identified 89% correctly and 11% incorrectly as V. cholerae or questionable. While the BDAL database (+SR) was only able to differentiate about 20% of the V. mimicus isolates correctly. The isolates of the species V. metoecus found by chance in this work always received the wrong result V. mimicus, because this species was not deposited in the databases.
To rapidly differentiate routine isolates in the future, it is recommended to first process V. cholerae-mimicus questionable isolates by direct transfer and matched with Vibrio-specific databases, e.g. VibrioBase. If the user does not have such databases available, they can create their own models in ClinPro Tools using the peaks at 4025 Da, 7969 Da, and 9122 Da for V. cholerae and 7958 Da, 9141 Da, 9477 Da and 9981 Da for V. mimicus and classify the isolates in a short time. Otherwise, these peaks can be searched in flexAnalysis after the spectra have been internally calibrated to the peak at 4279 Da. The species V. metoecus could not be differentiated because only two isolates were available. However, an experienceduser may be able to recognize the different nature of these spectra compared to V. cholerae and V. mimicus spectra.
To determine specific peaks for other species with very similar spectra, e.g. V. metoecus, in the future, it is recommended to grow the examined isolates under standardized conditions and to process them with the formic acid extraction. The search for specific peaks should first be performed in ClinPro Tools e.g. using the Total Average Spectrum, the Gelview function, ROC analysis or a combination of them. Appropriate models can then be generated. A rapid check in flexAnalysis should still be performed to identify unusual isolates. If ClinPro Tools is not available, visual comparison in flexAnalysis for stand-alone peaks or peak shifts is possible. An internal calibration of all spectra, e.g. to a genus-specific peak, should be performed. Das Ziel dieser Arbeit war es, die nahe verwandten Spezies V. cholerae und V. mimicus mittels MALDI-TOF MS und den zur Verfügung stehenden Standard-Softwares (flexAnalysis, MALDI Biotyper OC) und deren Tools schnell und sicher zu differenzieren. Später war es möglich, eine weitere Software (ClinPro Tools) und eine zusätzliche Vibrio-spezifische Datenbank (VibrioBase) zu erhalten und diese in die Untersuchungen einzubinden.
Zunächst wurden von 62 Vibrio-Isolaten 20 (zehn je Spezies) ausgewählt, um sie auf potentiell speziesdiskriminierende Peaks in der Software flexAnalysis zu untersuchen. Hier war eine interne Kalibrierung der Spektren auf einen gattungsgemeinsamen Peak (4279 Da) vorteilhaft, da sie einheitlich darauf ausgerichtet und Streuungen minimiert wurden. Auffällige Peaks mussten Auswahlkriterien standhalten, um als potentiell speziesdiskriminierend gewertet zu werden. Anschließend wurden diese Peaks anhand der bisherigen 20 und weiterer 42 Isolate validiert. Dabei ergab sich für V. cholerae eine Sensitivität von 97% und eine Spezifität von 100%, für V. mimicus waren es 93% und 97%.
Mit den Anwendungen der Software MALDI Biotyper OC konnten keine diskriminierenden Peaks ermittelt werden. Allerdings konnten die Spezies mit der Dendrogramm- und PCA-Funktion gut voneinander unterschieden werden, sofern Kontrollisolate mitgeführt wurden. Parallel wurden von den 42 o.g. Isolaten sowohl Spektren mittels Direkttransfer (BRUKER DALTONIK GmbH, 2013b) als auch mit der Ameisensäure-Extraktion (BRUKER DALTONIK GmbH, 2013a) erstellt und verglichen. Dabei machte sich schnell bemerkbar, dass der Direkttransfer eine erhebliche Einsparung von Arbeitsaufwand, -mitteln und -zeit erbringt.
Später wurde mit der Software ClinPro Tools festgestellt, dass sich die bisher gefundenen diskriminierenden Peaks hiermit sehr viel schneller ermitteln ließen. Besonders mit der Funktion, eigene Modelle zu generieren, ergäbe sich künftig mit dem Direkttransfer die Möglichkeit, ein Ergebnis für ein V. cholerae-mimicus-fragliches Isolat (von der Agarplatte bis zum Resultat) innerhalb von etwa 15 min zu erhalten. Allerdings hatte ClinPro Tools die Einschränkung, dass Spektren gleicher Isolate oder von sehr nahe verwandten Spezies, wie z.B. V. metoecus, nicht auffallen und nicht differenziert werden konnten. Bei dieser Problematik stellte sich flexAnalysis zwar als zeitintensiv, aber durch die sehr genaue Spektrenauswertung als geeigneter heraus.
Zu einem nochmals späteren Zeitpunkt wurden weitere elf Isolate vom BfR zur Verfügung gestellt, bei denen in vorherigen Untersuchungen widersprüchliche Speziesergebnisse auftraten. Diese Isolate wurden in gleicher Weise, wie die Bisherigen untersucht. In allen drei verwendeten Softwares und deren Anwendungen erhielten sie das Ergebnis V. mimicus. Dies
wurde später vom BfR über Genom-Sequenzanalysen bestätigt und es unterstützt die Anwendbarkeit der in dieser Arbeit untersuchten Differenzierungsmöglichkeiten nahe verwandter Bakterienspezies mittels MALDI-TOF MS.
Zuletzt wurde die Datenbank VibrioBase in MALDI Biotyper OC hinzugefügt. Es sollte geprüft werden, ob sich mit ihr die untersuchten Spezies besser differenzieren ließen als mit den bisher verfügbaren Datenbanken (BDAL und SR). V. cholerae-Isolate wurden sowohl mit der VibrioBase (+ SR) als auch mit der Bruker BDAL-Datenbank (+SR) zu 100% richtig identifiziert. Die V. mimicus-Isolate wurden zu 89% richtig identifiziert und zu 11% falsch als V. cholerae oder nicht sicher. Wohingegen die BDAL-Datenbank (+SR) nur etwa 20% der V. mimicus-Isolate korrekt differenzieren konnte. Die in dieser Arbeit zufällig gefundenen Isolate der Spezies V. metoecus erhielten immer das falsche Ergebnis V. mimicus, da diese Spezies in den Datenbanken nicht hinterlegt war.
Um künftig Routineisolate zügig zu differenzieren, wird empfohlen, V. cholerae-mimicus-fragliche Isolate zunächst per Direkttransfer aufzuarbeiten und mit Vibrio-spezifischen Datenbanken z.B. VibrioBase abzugleichen. Hat der Anwender keine solcher Datenbanken zur Verfügung, kann er eigene Modelle in ClinPro Tools mit den Peaks bei 4025 Da, 7969 Da und 9122 Da für V. cholerae und 7958 Da, 9141 Da, 9477 Da und 9981 Da für V. mimicus erstellen und die Isolate in kurzer Zeit klassifizieren. Andernfalls können diese Peaks selbst in flexAnalysis aufgesucht werden, nachdem die Spektren intern auf den Peak bei 4279 Da kalibriert wurden. Die Spezies V. metoecus konnte nicht differenziert werden, da nur zwei Isolate vorlagen. Allerdings kann ein erfahrener Anwender u.U. die Andersartigkeit dieser Spektren im Vergleich zu V. cholerae- und V. mimicus-Spektren erkennen.
Um künftig bei weiteren Spezies mit sehr ähnlichen Spektren, z.B. V. metoecus, spezifische Peaks selbst zu ermitteln, wird empfohlen, die zu untersuchenden Isolate unter standardisierten Bedingungen anzuzüchten und mit der Ameisensäure-Extraktion aufzuarbeiten. Die Suche nach spezifischen Peaks sollte zunächst in ClinPro Tools erfolgen z.B. mit dem Total Average Spektrum, der Gelview Funktion, der ROC Analyse oder einer Kombination daraus. Anschließend können entsprechende Modelle generiert werden. Eine kurze Überprüfung in flexAnalysis sollte trotzdem erfolgen, um auffällige Isolate zu erkennen. Steht ClinPro Tools nicht zur Verfügung, ist ein visueller Abgleich in flexAnalysis auf alleinstehende Peaks oder Peakshifts möglich. Dabei sollte eine interne Kalibrierung aller Spektren z.B. auf einen gattungsspezifischen Peak erfolgen.