Investigations into the endocannabinoid system and endocannabinoid-mediated control of energy homeostasis in late-lactating dairy cows

The endocannabinoid system (ECS) is a comprehensive and multifaceted system within the body of all vertebrates. It consists of G protein-coupled cannabinoid receptors, their endogenous ligands, the so-called endocannabinoids, and the corresponding synthesizing and degrading enzymes. In recent years, intensive research has provided insights into the key elements of the ECS and its vast involvement in many regulatory processes in non-ruminants, primarily rodents and humans. Several mechanisms of endocannabinoid action have been identified in terms of energy homeostasis with the regulation of feed intake and appetite, as well as the stress response and lipid and glucose metabolism. Nevertheless, numerous questions remain unanswered, especially with regard to ruminant species.
In dairy cows, targeted activation of the ECS may represent a promising therapeutic approach to overcome problems associated with the periparturient period, but the current understanding of the ECS in ruminants is insufficient. Therefore, the aim of the present work was to further characterize the fundamentals of the ECS in dairy cows and to investigate its involvement in the regulatory processes of energy homeostasis by administering the two major endocannabinoids N-arachidonoylethanolamide (anandamide, AEA) and 2-arachidonoylglycerol (2-AG). To achieve this aim, a series of experiments were conducted with non-pregnant, late-lactating Simmental cows.
A subset of experiments within this thesis was conducted for a better understanding of the dynamics of the circulatory endocannabinoid tone in dairy cows. Dairy cows were subjected to: (i) short-term feed deprivation; (ii) stress exposure; (iii) different diet compositions (low and high n6/n3 fatty acid ratio); and (iv) i.p. injections of AEA and 2-AG, with subsequent analysis of plasma endocannabinoid concentrations. Analyses revealed that both feed deprivation and stress exposure increase plasma 2-AG levels to varying degrees in ruminants, similar to nonruminates, whereas plasma AEA levels remained constant. It seems that in dairy cows, 2-AG appears to be more involved in the systemic metabolic response to feed deprivation and stress exposure than AEA. Contrary to expectations, feeding a high n6/n3 diet did not increase plasma endocannabinoid concentrations in dairy cows. Systemic administration of AEA increased circulatory AEA concentrations 2.5 h after injection, while administration of 2-AG did not change plasma endocannabinoid concentrations 2.5 h after injection. The apparent differences in the bioavailability of injected AEA and 2-AG and possible accumulation of AEA, require more detailed studies in the future.
To investigate the effects of i.p. administered endocannabinoids on feed intake and hypothalamic orexigenic signaling in dairy cows, feed intake was continuously measured by electronic registration devices and analyzed in different intervals. Analyses revealed that i.p. administered AEA and 2-AG at doses of 5 μg/kg and 2.5 μg/kg, respectively, mainly affected feed intake in the short-term within the first hour after treatment and had no long-term effect. At the end of the trial, cows were slaughtered 2 to 3 hours after i.p. endocannabinoid injection, and brain tissue was collected for immunohistochemical analysis of agouti-related peptide (AgRP), orexin A (OX-A), and cannabinoid receptor 1 (CB1) expressing neurons, and for PCR analysis of AgRP, neuropeptide Y (NPY), and genes related to the ECS. The immunohistological investigation of hypothalamic orexigenes revealed, however, no neuromodulatory effect of either treatment on immunoreactivity or c-Fos activation. The mRNA gene expression of ECS-related genes in the arcuate (ARC) and paraventricular (PVN) nuclei of dairy cows was also not different between treatment groups. However, NPY and AgRP mRNA abundances were downregulated in the ARC of AEA-treated animals, which might indicate a possible counter-regulatory mechanism.
To test whether cows may benefit from injected endocannabinoids during stress in terms of stress-induced alterations in feed intake, feed intake was compared with and without exposure to stress stimuli such as social and tactile isolation, and tethering. In fact, AEA and 2-AG administration seemed to attenuate stress-induced hypophagia.
To further understand the influence of administered endocannabinoids on the level of whole-body metabolism, cows were kept in respiration chambers twice for three days, and gas exchange was recorded every 6 minutes for detailed analysis. Treatment with AEA and 2-AG increased whole-body carbohydrate oxidation (COX) and metabolic heat production (HP) and decreased whole-body fat oxidation (FOX), mirroring the endocannabinoid-mediated changes in feed intake mentioned above. An analysis independent of feed intake showed that COX was not different between treatment groups, whereas FOX remained lower with endocannabinoid treatment, suggesting that effects extend beyond individual differences in feed intake and that AEA and 2-AG indeed suppress whole-body fat catabolism and/or support lipogenesis. To gain an initial understanding of the effects of administered endocannabinoids on lipid metabolism, plasma samples were collected before and after 9 days of daily treatment and analyzed for plasma non-esterified fatty acids (NEFA) and specific plasma lipid concentrations. We demonstrated that injected endocannabinoids attenuated the increase in plasma free fatty acid concentration associated with stress-induced hypophagia. Furthermore, the analyses suggest that possibly with endocannabinoid application, free fatty acids are used to an increased extent for triglyceride synthesis in adipocytes.
In conclusion, the herein discussed results offer new and significant insights into the ECS in dairy cows. This field of research is still in its early stages; thus, much remains to be discovered including the potential for beneficial therapeutic intervention. However, this thesis and the studies published within provide a direction and serve as a foundation for future research. Untersuchungen zum Endocannabinoidsystem und zur endocannabinoidvermittelten Kontrolle der Energiehomöostase bei spätlaktierenden Milchkühen

Das Endocannabinoid-System (ECS) ist ein umfassendes und vielschichtiges System im Körper aller Wirbeltiere. Es besteht aus G-Protein-gekoppelten Cannabinoidrezeptoren, ihren endogenen Liganden – den sogenannten Endocannabinoiden – und den entsprechenden synthetisierenden und abbauenden Enzymen. In den letzten Jahren hat intensive Forschung wertvolle Einblicke in die Schlüsselelemente des ECS und seine weitreichende Beteiligung an vielen Regulationsprozessen bei Nicht-Wiederkäuern, vor allem bei Nagetieren und Menschen, ermöglicht. Im Hinblick auf die Energiehomöostase mit der Steuerung der Futteraufnahme und des Appetits sowie der Stressreaktion und des Lipid- und Glukosestoffwechsels wurden viele Mechanismen der Endocannabinoidwirkung identifiziert. Dennoch blieben viele Fragen unbeantwortet, insbesondere in Bezug auf Wiederkäuer.
Bei Milchkühen könnte die gezielte Aktivierung des ECS ein vielversprechender therapeutischer Ansatz zur Bewältigung von Problemen in der Transitphase darstellen, jedoch ist das derzeitige Verständnis über das ECS bei Wiederkäuern nicht ausreichend. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Grundlagen des ECS bei Milchkühen weiter zu charakterisieren und seine Beteiligung an den Steuerungsprozessen der Energiehomöostase durch Verabreichung der beiden Endocannabinoide N-Arachidonylethanolamid (Anandamid, AEA) und 2-Arachidonylglycerol (2-AG) zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden eine Reihe von Versuchen mit nicht trächtigen, spätlaktierenden Simmentaler Kühen durchgeführt.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um ein besseres Verständnis der Dynamik des zirkulatorischen Endocannabinoid-Tonus bei Milchkühen zu erlangen. Milchkühe wurden (i) kurzzeitigem Futterentzug, (ii) Stressbelastung, (iii) verschiedenen Rationszusammensetzungen (niedriges und hohes n6/n3-Fettsäureverhältnis) und (iv) i.p.-Injektionen von AEA und 2-AG ausgesetzt, mit anschließender Analyse der Plasma-Endocannabinoid-Konzentrationen. Die Analysen ergaben, dass sowohl Futterentzug als auch Stressbelastung die 2-AG-Konzentration im Plasma von Milchkühen in unterschiedlichem Maße erhöhten, ähnlich wie bei Nicht-Wiederkäuern, während die AEA-Konzentration im Plasma unverändert blieb. Es scheint, dass 2-AG bei Milchkühen stärker an der systemischen Stoffwechselreaktion auf Futterentzug und Stressbelastung beteiligt ist als AEA. Anders als bei Nicht-Wiederkäuern führte die Fütterung einer n6/n3-reichen Ration bei Milchkühen nicht zu einer Erhöhung der Endocannabinoid-Konzentrationen im Plasma. Die systemische Verabreichung von AEA erhöhte 2,5 Stunden nach der Injektion die AEA-Konzentrationen im Blutkreislauf, während die Verabreichung von 2-AG die Endocannabinoid-Konzentrationen im Plasma 2,5 Stunden nach der Injektion nicht veränderte. Die Unterschiede in der Bioverfügbarkeit von injiziertem AEA und 2-AG und die mögliche Akkumulation von AEA erfordern in Zukunft genauere Untersuchungen.
Um die Auswirkungen von i.p. verabreichten Endocannabinoiden auf die Futteraufnahme und die hypothalamische orexigene Signalgebung bei Milchkühen zu untersuchen, wurde die Futteraufnahme kontinuierlich elektronisch erfasst und in verschiedenen Intervallen analysiert. Die Analysen ergaben, dass i.p. verabreichtes AEA und 2-AG in einer Dosierung von 5 μg/kg bzw. 2,5 μg/kg hauptsächlich die Futteraufnahme kurzfristig innerhalb der ersten Stunde nach der Behandlung beeinflusste und keine Langzeitwirkung hatte. Am Ende des Versuchs wurden die Kühe 2 bis 3 Stunden nach der i.p. Endocannabinoid-Injektion geschlachtet, und es wurde Hirngewebe für die immunhistochemische Analyse von Agouti-related Peptid (AgRP), Orexin A (OX-A) und Cannabinoid-Rezeptor (CB1) exprimierenden Neuronen sowie für die PCR-Analyse von AgRP, Neuropeptid Y (NPY) und Genen, die mit dem ECS in Verbindung stehen, entnommen. Aus immunhistochemischen Untersuchungen hypothalamischer Orexigene ergaben sich allerdings keine Hinweise auf eine endocannabinoidvermittelte Neuromodulation oder c-Fos-Aktivierung. Die Genexpression von ECS-assoziierten Genen im Nucleus arcuatus (ARC) und Nucleus paraventricularis (PVN) von Milchkühen auf mRNA-Ebene unterschied sich ebenfalls nicht zwischen den Behandlungsgruppen. Allerdings wurden die mRNA-Abundanzen von NPY und AgRP im ARC von AEA-behandelten Tieren herunterreguliert, was auf einen möglichen gegenregulatorischen Mechanismus hinweisen könnte.
Um zu testen, ob Kühe möglicherweise von der Verabreichung von Endocannabinoiden bei Stress im Hinblick auf stressbedingte Veränderungen der Futteraufnahme profitieren, wurde die Futteraufnahme mit und ohne Stressreize wie soziale und taktile Isolation und Anbindehaltung verglichen. Es wurde herausgefunden, dass die Verabreichung von AEA und 2-AG die stressinduzierte Hypophagie abschwächt.
Um den Einfluss der verabreichten Endocannabinoide auf den Gesamtstoffwechsel besser zu verstehen, wurden die Kühe zweimal drei Tage lang in Respirationskammern gehalten, um den Gasaustausch kontinuierlich aufzuzeichnen. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit AEA und 2-AG zu einem Anstieg der Kohlenhydratoxidation (COX) und der metabolen Wärmeproduktion (HP) sowie zu einem Rückgang der Fettoxidation (FOX) führte, was die oben erwähnten endocannabinoidvermittelten Veränderungen der Futteraufnahme widerspiegelt. Eine von der Futteraufnahme unabhängige Analyse zeigte, dass sich die COX-Werte zwischen den Behandlungsgruppen nicht unterschieden, während die FOX-Werte unter der Endocannabinoid-Behandlung niedriger blieben, was darauf hindeutet, dass die Endocannabinoidwirkung über die Effekte auf Futteraufnahme hinausgeht, und dass AEA und 2-AG den Fettabbau unterdrücken und die Lipogenese fördern. Um ein erstes Verständnis der Auswirkungen der verabreichten Endocannabinoide auf den Fettstoffwechsel zu gewinnen, wurden vor und nach 9 Tagen täglicher Behandlung Plasmaproben entnommen und auf die Konzentration freier Fettsäuren im Plasma sowie auf weitere Plasmalipidkonzentrationen untersucht. Wir konnten zeigen, dass die injizierten Endocannabinoide den mit der stressinduzierten Hypophagie verbundenen Anstieg der Konzentration freier Fettsäuren im Plasma abschwächten. Ferner deuten die Analysen darauf hin, dass möglicherweise mit Endocannabinoid-Applikation freie Fettsäuren in erhöhtem Maße zur Triglyceridsynthese in Adipozyten verwendet werden.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die hier diskutierten Ergebnisse neue und wichtige Erkenntnisse über das ECS bei Milchkühen liefern. Dieses Forschungsgebiet befindet sich noch in der Anfangsphase, und es sind weitere Studien zum ECS bei der Milchkuh notwendig, um das therapeutische Potential von Endocannabinoiden weiter zu heben. Die vorgestellten Ergebnisse und die veröffentlichten Studien dienen jedoch als Grundlage für künftige Forschungen.