Immunhistologische Charakterisierung feliner Meningeome und Etablierung feliner Meningeomzellkulturen

Diese Doktorarbeit diente der klinischen Reevaluierung feliner Meningeom-Patienten, dem histologischen Regrading der Tumoren anhand der humanmedizinischen WHO-Klassifikation aus dem Jahr 2016 (Louis et al., 2016), der Charakterisierung des immunhistochemischen Expressionsmusters feliner Meningeome sowie der Etablierung einer Zellkultur aus einem felinen Meningeom.
Die klinische Reevaluierung der felinen Meningeom-Patienten ergab einen guten Therapieerfolg bei den durch operative Tumorexstirpation therapierten Patienten. Bis auf eine Patientenbesitzerin berichteten alle von einem guten Regenerationsgrad nach der Operation. Es lag eine mittlere Überlebenszeit von 32 Monaten vor mit einer maximalen Überlebenszeit von neun Jahren. Das Meningeom wurde bei den erfolgreich operierten Patienten nur in einem Fall eines spinalen Meningeoms mit zwei Rezidiven als Todesursache durch Euthanasie angegeben. Die Rezidivrate lag insgesamt bei 37%, wobei in einem Fall keine Symptome durch das Rezidiv ausgelöst wurden und im anderen Fall eine Re-Operation das Leben der Katze um weitere vier Jahre verlängerte. Es zeigte sich demnach, dass eine Re-Operation durchaus erfolgversprechend sein kann. Trotz des sehr guten Therapieerfolges durch die Operation wenn die unmittelbare postoperative Phase überlebt wurde, stellt eine Kraniotomie einen risikoreichen Eingriff dar. Insgesamt verstarben 25% der felinen Patienten perioperativ.
Im tierartlichen Vergleich mit den Daten aus der Studie von Will (2020) zeigt sich, dass die Überlebenszeiten der Katzen nach chirurgischer Intervention wesentlich länger waren als die der untersuchten Hunde. Die durchschnittliche Überlebenszeit der Hunde lag bei 43 Wochen (9,8 Monaten) nach Operation. Das Meningeom stellte zudem bei der Hälfte dieser erfolgreich operierten Hunde dennoch letztendlich die Todesursache dar.
Das histologische Regrading ergab, dass alle untersuchten felinen Meningeome vom fibromatösen, transitionalen, meningothelialen oder psammomatösen Subtyp waren. Dies sind alles Subtypen, die dem Grad I zuzuordnen sind. Bei den durch Will untersuchten kaninen Meningeomen hatten zusätzlich die Subtypen granularzellig, papillär, mikrozystisch und klarzellig vorgelegen. Psammomatöse Meningeome waren bei den untersuchten Katzen deutlich häufiger (24%) als bei den Hunden (4%). Auch der fibromatöse Subtyp war mit 15 % im Vergleich zum Hund mit 4% häufiger vertreten, wohingegen bei den kaninen Meningeomen der meningotheliale Subtyp mit 41% überwog, welcher bei den Katzen nur 15% ausmachte. Bei den felinen Meningeomen waren 94% dem benignen Grad I zuzuordnen, 6% dem maligneren Grad II und keines dem Grad III. Bei den Grad II Tumoren handelte es sich in einem Fall um einen Tumor mit erhöhter Mitoseaktivität und in einem Fall um einen Tumor mit Hirninvasion. Ersterer zeigte auch klinisch ein rasches Rezidiv-Verhalten, zweiterer war einem Sektionstier mit vorberichtlich neurologischen Symptomatik entnommen worden. Eine Korrelation des histologischen Grades und des biologischen Verhaltens der Tumoren war aufgrund der Tatsache, dass auch als Grad I eingestufte feline Meningeome rezidiviert hatten, nicht zuverlässig festzustellen.
Bei den kaninen Tumoren aus der Studie von Wills (2020) waren nur 16% als Grad I eingeordnet worden, 54% als Grad II und 29% als Grad III. Die kaninen Meningeome waren demnach histologisch als deutlich maligner einzustufen als die felinen Meningeome. Die untersuchten Hunde zeigten auch einen deutlich schlechteren klinischen Outcome als die Katzen. Dies zeigt, dass das humanmedizinische histologische WHO-Grading (2016) durchaus auch in der Tiermedizin eine prognostische Relevanz zu haben scheint. Innerhalb der felinen Patienten war die Prognose anhand des WHO-Grades allerdings nicht zuverlässig abzuschätzen, da diese fast alle als Grad I einzustufen waren und dennoch einen ganz unterschiedlichen klinischen Outcome aufwiesen.
Neben dem histologischen Regrading widmete sich diese Arbeit in Anlehnung an die Arbeit von Will (2020) der immunhistochemischen Untersuchung der felinen Meningeome mit den bereits etablierten Markern Vimentin, S100, GFAP und Zytokeratin. Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung neuer diagnostischer und bestenfalls prognostischer immunhistochemischer Marker. Die Etablierung von Desmoplakin als diagnostischer Marker und PHH3 als potenzieller prognostischer Marker gelang an den felinen Meningeomen problemlos. Die Etablierung eines Antikörpers für EMA und SSTR2A gelang trotz multipler Protokoll-Anpassungen nicht. EMA und SSTR2A stellen in der Humanmedizin die zum aktuellen Zeitpunkt wichtigsten immunhistochemischen Marker von Meningeomen dar. Die felinen Meningeome zeigten ebenfalls eine fragliche SSTR2A-Expression. Dennoch sollte die Etablierung möglicherweise mit anderen Antikörpern gegen SSTR2A unter anderen Bedingungen weiter getestet werden, da der Somatostatin-Rezeptor auch einen Ansatzpunkt für medikamentöse Therapien mit Somatostatin-Analoga darstellt und eine Expression von SSTR2A durch Meningeome anhand der Ergebnisse dieser Studie zumindest nicht ausgeschlossen werden kann.
Es zeigte sich, dass die felinen Meningeome fast alle demselben immunhistochemischen Expressionsmuster folgten mit einer Expression von Vimentin (stark, diffus, viele Zellen betreffend), S100 (schwächer, fokal, nur wenige Zellen betreffend) und Desmoplakin (stark, diffus, viele Zellen betreffend). Die meisten Meningeome waren hingegen negativ für GFAP und Zytokeratin. Einzelne Tumoren wiesen vereinzelte Abweichungen auf, wie eine leichte GFAP- oder Zytokeratin-Expression oder eine nicht vorhandene S100-Expression. Es gab in dieser Studie Hinweise darauf, dass eine positive Zytokeratin-Färbung bei felinen Meningeomen mit einer schlechteren Prognose assoziiert sein könnte. Die PHH3-Färbung war bei allen Tumoren gegeben, zeigte aber in nur einem Fall mehr als 4 Mitosen pro 10 HPF (Grad II) und in keinem Fall mehr als 20 Mitosen pro 10 HPF (Grad III) bei den felinen Meningeomen.
Es zeigte sich, dass sich feline und kanine Meningeome sowohl in Hinsicht auf ihr histologisches Erscheinungsbild als auch in ihrer klinischen Ausprägung und dem Operations-Erfolg deutlich unterschieden. Lediglich das immunhistochemische Expressionsprofil lieferte ähnliche Ergebnisse bei beiden Tierarten. Hierbei fiel nur ein Unterschied in der Proliferationsaktivität der Tumoren beider Tierarten auf, welcher zu einer stärkeren PHH3-Expression der kaninen Meningeome führte. Die anderen immunhistochemischen Marker zeigten ein sehr ähnliches Expressionsmuster bei Proben beider Tierarten. Dass Meningeome bei Hunden und Katzen eine unterschiedliche klinische Ausprägung und eine unterschiedlich gute Prognose in Bezug auf den Therapieerfolg aufweisen und dennoch ein sehr ähnliches immunhistochemisches Expressionsmuster haben zeigt, dass sich die Immunhistochemie mit den Markern Vimentin, S100, Zytokeratin, GFAP und Desmoplakin für die Diagnose eines Meningeoms eignet, jedoch keine signifikante prognostische Aussagekraft liefert. Diese Arbeit zeigt, dass gerade bei felinen Meningeomen der histologische Grad meist als benigne eingeschätzt wird und nicht zuverlässig mit dem Outcome des individuellen Patienten korreliert. Dies deckt sich mit den Angaben aus der Humanmedizin, in der gerade Grad I Tumoren doch gelegentlich ein maligneres Verhalten aufweisen als ihre Histologie vermuten lässt. Daher gewinnen dort molekularpathologische Untersuchungen zunehmend an Bedeutung, um die Prognose des einzelnen Meningeom-Patienten abzuschätzen. Dies stellt einen wichtigen und interessanten Schwerpunkt für zukünftige veterinärmedizinische Arbeiten dar. Es zeigt sich, wie veraltet die veterinärmedizinische WHO-Klassifikation (Koestner et al. 1999) insgesamt ist.
Ein weiterer Schwerpunkt war die Etablierung einer primären Zellkultur aus felinen Meningeomzellen. Dies diente dazu, eine Grundlage für spätere Forschungsarbeiten zur Immortalisierung und in vitro Testungen von Chemotherapeutika zu bilden. Gerade bei kaninen Meningeomen ist, wie oben beschrieben, die Operation eher durch einen mittelfristigen Therapieerfolg charakterisiert, weshalb alternative Therapieoptionen wie eine Chemotherapie an Bedeutung gewinnen könnten. Die Etablierung einer primären Zellkultur gelang aus frischem Tumorgewebe zweier verschiedener feliner Meningeome vom psammomatösen und meningothelialen Subtyp gut. Die Charakterisierung der Zellen mittels Immunfluoreszenz und Immunhistochemie am Zellpellet ergab, dass die Kulturzellen den Zellen des Ursprungsgewebes entsprachen. Die Kulturen ließen sich mehrfach subkultivieren, ohne ihr Wachstumsverhalten stark zu verändern. Dies stellt eine vielversprechende Grundlage für zukünftige Forschungsarbeiten dar. This study aimed at re-evaluating the data of feline patients with meningioma in order to regrade the tumors histologically by means of the human medicine WHO classification from 2016 (Louis et al., 2016) to characterize the immunhistochemical expression pattern of feline meningioma, and to establish a primary cell culture from a feline meningioma.
The clinical re-evaluation revealed a good therapeutic success by surgical removal of the tumor in feline patients. All owners except one reported a good regeneration of their cats post operatively and said that they would choose to perform the surgery in another pet again. The median survival time was 32 months with a maximum survival time of 9 years in one patient. Only in one case of a spinal meningioma with two recurrences the meningioma was the cause of death by euthanasia. The recurrence rate was 37%. One cat didn’t show any symptoms due to the relapse and another one was reoperated, which prolonged his survival for five more years. The data showed that a reoperation can be a promising approach. Despite a good prognosis of survival and regeneration when the patient survived the postoperative period, a craniotomy is a high-risk intervention. 26% of the cats died perioperatively.
The comparison with the data of the study by Johanna Will (2020) showed that the median survival time of cats after surgical intervention was far longer than the one of the examined dogs. The median survival time of dogs was 43 weeks (9,8 months) after surgery. Moreover, at the end, the meningioma was the cause of death in half of the canine cases after successful surgery.
The histological regrading showed that all feline meningiomas were fibrous, transitional, meningothelial or psammomatous. These subtypes are graded as Grade I meningiomas. The dogs investigated by Will (2020) additionally showed the granular cell, papillary, microcystic and clear cell subtypes. Psammomatous meningeomas were more common in cats (24%) than in dogs (4%). The fibromatous subtype was more common in cats (15%) than in dogs (4%) as well. The meningothelial subtype was more frequent in dogs (41%) than in cats (15%).
94% of the feline meningiomas were Grade I tumours, 6% the more malignant Grade II, and none of the tumours was Grade III. One of the Grade II tumours was characterized as more malignant by its proliferation activity and the other one by brain invasion. The first one showed two quick recurrences of the tumour after surgery, the second one was taken out of a dissected animal that hadn’t shown any neurological symptoms prior to his death. This is why it was not possible to find a reliable correlation of the histological grading and the biological behaviour of the tumours, especially as other grade I meningeomas in this study had relapses as well.
In the group of canine meningiomas, there were 16% grade I, 54 % grade II and 29% grade III (Will 2020). Therefore, the canine meningiomas had a much more malignant histological appearance than the feline meningiomas. Canine patients showed a worse outcome than the feline patients as well. This shows that the histological WHO-grading in human neoplasias (2016) seems to have a prognostic relevance in veterinary medicine as well. Among cats, it was not possible to estimate the prognosis of the individual animal by the histological grade, because almost all of the meningiomas were graded as grade I and still had different clinical outcomes.
In addition to the histological regrading, this study investigated the immunhistochemical expression pattern of the feline meningiomas with the already established markers vimentin, S100, GFAP and cytokeratine. Another focus was the establishment of new diagnostic and in the best case prognostic immunhistochemical markers. The establishment of the diagnostic marker desmoplakin and PHH3 as possible prognostic marker succeeded. The use of an antibody against EMA and SSTR2A wasn’t successful although multiple adjustments of the protocols were tried. At the moment, EMA and SSTR2A are the most important immunhistochemical markers for meningeoma in human medicine. Feline meningiomas did show an expression of SSTR2A, but the positive controls showed a nonspecific staining of multiple tissues as well, so that the staining of the meningeomas was rated as not evaluable. Nevertheless, there should be more studies about the establishment of other antibodies against SSTR2A on feline meningeome tissues under different circumstances. The somatostatin receptor 2A is a target for medical treatment with somatostatin analoga and the possibility that feline meningiomas can express SSTR2A with the data from this study can not be ruled out.
The immunhistochemical investigations showed that the feline meningeoms almost all followed the same expression patterns with a positive staining for vimentin (strong, diffusely), S100 (mild, focally) and desmoplakin (strong, diffusely) and a negative staining for GFAP and cytoceratine. Individual tumours showed little divergences such as a mild expression of GFAP or cytoceratin or no expression of S100. The data of this study suggest that the expression of cytokeratin might be associated with a worse prognosis in feline meningioma. Every tumour showed a different amount of positive PHH3 staining, depending on its proliferation activity. Only one case of the feline meningiomas showed more than 4 mitoses per 10 HPF (grade II) and in no case there were more than 20 mitoses per 10 HPF (grade III).
It was shown that feline and canine meningeomas differ in their histological appearance and their clinical characterics as well as in the success of the surgical therapy. In contrast, the immunhistochemical examination showed similar expressions of the antigens in meningeomas of both species. There was only a difference in the proliferation activity which led to a stronger expression of PHH3 in most of the canine meningiomas. The fact that meningiomas of dogs and cats have such a different outcome and prognosis and still have almost the same immunhistochemical expression patterns shows, that the markers vimentin, S100, cytoceratin, GFAP and desmoplakin in these species seem to have a good diagnostic, but no significant prognostic value.
The results of this study show that especially in feline meningiomas, which almost exclusively are histologically graded as grade I, this grading often fails to correlate with the outcome of the individual patient. This corresponds with the data from human medicine, where especially grade I meningiomas sometimes show a more malignant biological behaviour than the histological grade predicted. This is the reason why molecular pathological examinations gain more significance these days with regard to estimating the prognosis of individual patients. This is reflected in the new version of WHO classification from 2021. In veterinary medicine, at the moment there are no scientific studies about this subject, but it seems to be an important and interesting topic for further examination. The results show how obsolete the actual veterinary WHO classification is (Koestner et al., 1999). Another focus of this thesis was the establishment of a primary cell culture out of feline meningioma cells as a basis for further studies about immortalization and in vitro testings of chemotherapeutics. Especially in canine meningiomas, as previously mentioned, the surgery is rather characterized by a middle-term therapy success. Thus, alternative therapy options such as chemotherapy could gain in importance.
The establishment of a primary cell culture out of two different feline meningioma tissues was successful. One of the tumours was psammomatous and the other one meningothelial. The characterization of the cells with immunfluorescence and immunhistochemistry was possible as well and showed that the expression corresponded with the one of the original tumour. Subculturing was possible for several times without changes in growth behaviour of the cells. This is a promising basis for future scientific studies.