Etablierung der Phagen-Display-Methodik zur Herstellung von Einzeldomänen-Antikörpern aus Kameliden

Einzeldomänen-Antikörper aus Kameliden stellen im Bereich biomedizinischer Forschung, Diagnostik und Therapie heutzutage wichtige Werkzeuge dar, weshalb an der Universität des Saarlandes die Phage-Display-Methodik zur Generierung von Einzeldomänen-Antikörpern etabliert werden sollte. Darüber hinaus war es das Ziel Einzeldomänen-Antikörper gegen ausgewählte Proteine zu synthetisieren, die mit konventionellen Antikörpern bislang nur schwer markierbar waren. Diese sogenannten Nanobodies leiten sich von den Schwere-Ketten-Antikörpern (= HcAb´s) ab und stellen den Antigen-bindenden Teil der Antikörper (= VHH) dar. Im Vergleich zu konventionellen Antikörpern zeigen sie Vorteile durch ihre geringe Größe (15 kDa) und ihrer Stabilität gegenüber Hitze und pH-Wert-Veränderungen. Sie besitzen mit einer fingerförmigen Paratopstruktur die Eigenschaft schwer erreichbare, d.h. unzureichend exponierte, Epitope zu binden. Darüber hinaus ist eine Amplifikation in E. coli schnell und unkompliziert möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Lama Romeo mit fünf Proteinen (CaVβ2, CaVβ3, mFl, CAPS2, Unc119) immunisiert und nach bestätigter Immunreaktion mittels Western-Blot-Analyse des Serums eine Aufreinigung der peripheren Lymphozyten (= PBL´s) durchgeführt. Nach der RNA-Extraktion und Amplifikation der VHH-Gene über PCR erfolgte eine Klonierung in den Phagemidvektor pMES4, der anschließend in E. coli transformiert wurde. Die Bestätigung der erfolgreichen Klonierung erfolgte mittels Kolonie-PCR. Über eine Superinfektion der Bakterien mit Helferphagen konnten rekombinante Phagen, auf deren Oberfläche die Nanobodies präsentiert werden, amplifiziert und somit eine Phagenbibliothek erstellt werden. Mit dem anschließenden panning wurden die VHH´s auf die verschiedenen Proteine selektioniert. Nach zwei bis drei Anreicherungsrunden erfolgte eine Infektion von E. coli mit den selektierten Phagen und ausgewählte Einzelklone wurden näher charakterisiert. Dazu wurden neben der Sequenzanalyse und anschließender Einteilung in Familien (monoklonale Antikörper) erste Bindungs- und Affinitätsstudienstudien mittels ELISA oder Western Blot durchgeführt. Nach erfolgreicher Synthese spezifischer Nanobody-Einzelklone wurden selbige an die kooperierenden Arbeitsgruppen für externe Studien abgegeben. Hier liegen bereits positive Ergebnisse in der Immunhistochemie und Röntgenkristallographie vor.
Die hier beschriebene und erfolgreich etablierte Phage-Display-Methodik ermöglicht eine hoch-effiziente Produktion von Einzeldomänen-Antikörpern in E. coli-Kulturen zum Einsatz in der biomedizinischen Forschung. Somit können Versuchstiere, die zur Produktion polyklonaler oder monoklonaler Seren verwendet werden, zum einen von der Anzahl der Versuchstiere reduziert werden. Darüber hinaus können aber auch die Eingriffe am Tier selbst durch die Multipleximmunisierungen und das wenig invasive Immunisierungsschema auf ein Minimum beschränkt werden, was einen bedeutenden ethischen Vorteil darstellt. Nowadays, single-domain antibodies from camelids represent important tools in the field of biomedical research, diagnostics and therapy, which is why the phage display methodology for generating single-domain antibodies should be established at the UKS site in order to produce antibodies against antigens which cannot be marked by conventional antibodies. These so-called nanobodies are derived from heavy chain antibodies (= HcAb’s) and represent the antigen-binding part (= VHH). Compared to conventional antibodies, they convince with their small size (15 kDa), their stability against heat and pH-value changes and, with their finger-shaped paratope, they have the property to bind hidden and hard-to-reach epitopes. In addition, amplification in E. coli is fast and uncomplicated. In this work, the llama Romeo was immunized with five proteins (CaVβ2, CaVβ3, mFl, CAPS2, Unc119) and after confirmed immunoreaction by western blot analysis of the serum a purification of the PBL’s was performed. After RNA extraction and amplification of the VHH genes via PCR, cloning was performed into the phagemid vector pMES4, which was subsequently transformed into E. coli. The successful cloning was confirmed by colony PCR. Via superinfection with helper phages, recombinant phages, on the surface of which the nanobodies are presented, were amplified and thus a phage library was created. Subsequent panning was used to select the VHHs for the various proteins. After two to three rounds of enrichment, E. coli was infected with the selected phages and individual clones were determined and characterized in more detail. In addition to sequence analysis and subsequent classification into families (monoclonal antibodies), initial binding studies were carried out using ELISA or Western blot. After successful synthesis of specific nanobodies, single clones were given to the cooperating working groups to carry out further studies. Positive results in immunohistochemistry and X-ray crystallography are already available here.
The phage display methodology described and successfully established here enables highly efficient production of single domain antibodies in E. coli cultures for use in biomedical research. Thus, experimental animals used for the production of polyclonal or monoclonal sera can be reduced in number. In addition, however, the interventions on the animal itself can be kept to a minimum due to the multiplex immunisations and the less invasive immunisation scheme, which represents a significant ethical advantage.