Untersuchungen zum Nachweis von Verotoxin-bildenden Escherichia coli O157 aus artifiziell kontaminierten Rindfleischproben

E. coli O157:H7 stellt in Rindfleisch aus lebensmittelhygienischer Sicht nach wie vor ein ernstzunehmendes Risiko für den Verbraucher dar, insbesondere aufgrund der Schwere der Erkrankungsverläufe. Die niedrige Infektionsdosis des Erregers bei gleichzeitig inhomogener Verteilung im Lebensmittel stellt die Diagnostik vor besondere Herausforderungen. Ziel der eigenen Untersuchungen war die Erfassung niedriger E. coli O157:H7-Konzentrationen aus Rinderhackfleisch- und „beef trim“-Proben. Dabei sollte gleichzeitig geprüft werden, ob mit Alternativverfahren im Vergleich zu einem etablierten Referenzverfahren eine Reduzierung der Gesamtuntersuchungszeit ermöglicht werden kann.
Als Referenzverfahren diente die Untersuchungskaskade gemäß Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 5.04 des United States Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service (FSIS). Die Einwaagen betrugen 65 g, als Anreicherung wurde die modifizierte Trypton-Soja-Bouillon mit Novobiocin (mTSB+N) eingesetzt. Der spezifische Nachweis von E. coli O157:H7 erfolgte mittels immunomagnetischer Separation (IMS), Sub-kultivierung auf modifiziertem Rainbow® Agar O157, Latex-Agglutination, biochemischer Reihe sowie dem Duopath® Verotoxin-Gold Labelled Immuno Sorbent Assay (GLISA).
Im Alternativverfahren erfolgte die Anreicherung von jeweils 375 g-Proben in RapidcultTM E. coli-Bouillon, gefolgt von IMS, Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Singlepath® E. coli O157-GLISA und kultureller Bestätigung über den MacConkey-Sorbitol Agar mit Cefixim und Tellurit (CT-SMAC-Agar). Dabei wurden drei verschiedene Beprobungszeitpunkte (acht, zehn und 22 Stunden) berücksichtigt.
Insgesamt wurden 240 Proben untersucht, zugehörig zu den Matrizes Rinderhackfleisch (n=108) und „beef trim“ (n=132). Nach einer Kälte-Behandlung wurde der E. coli O157:H7-Referenzstamm ATCC 35150 in einer Konzentration von ein bis drei Kolonie-bildenden Ein-heiten (KbE) pro Probe (fraktioniert-positive Proben) bzw. mit 103 KbE/Probe (Positiv-Kontrollen) inokuliert. Zur statistischen Auswertung wurden für gepaarte bzw. ungepaarte Proben Wiederfindungsrate, Sensitivität und Spezifität berechnet. Die Ergebnisse wurden zur Sicherstellung der Vergleichbarkeit nach Validierungskriterien gemäß „Intention-to-Treat“ (ITT)- und „Per Protocol“ (PP)-Verfahren ausgewertet.
In den eigenen Untersuchungen gelang es, die wenigen Erregerzellen trotz Kältestress und hoher Begleitflora im Lebensmittel zuverlässig zu erfassen, sowohl in fraktioniert-positiven als auch in den Kontroll-Proben. Mit den Anreicherungen gelang es, den inokulier-ten E. coli O157:H7-Referenzstamm auf ein detektierbares Niveau zu vermehren. Insbe-sondere die RapidcultTM-Bouillon überzeugte mit einer überlegenen weil höheren Wiederfin-dungsrate im statistischen Vergleich zur mTSB+N. Durch die spezifische Eigenschaft dieses neuen Mediums, den Zielerreger in kürzer Anreicherungszeit besser als das Referenzmedi-um auf eine detektierbare Konzentration zu vermehren, konnte die als „Nadelöhr“ der Un-tersuchungsdauer geltende Anreicherungszeit zudem deutlich von 22 h auf acht bzw. zehn Stunden reduziert werden. Die Gesamtuntersuchungszeit bis zum Erhalt von Verotoxin-positiven Isolaten konnte von fünf Tagen auf drei Tage gesenkt werden. In beiden Matrizes, „beef trim“ und „Rinderhackfleisch“, erwiesen sich acht bzw. zehn Stunden Bebrütungszeit als optimal. Der Einsatz von Screeningverfahren mit immunologischem (Singlepath® E. coli O157-GLISA) sowie molekularbiologischem Verfahren (RT-PCR mit foodproof® E. coli O157 Detection Kit 5‘ Nuclease) ermöglichte innerhalb eines Tages eine Einschätzung dar-über, ob präsumtiv verdächtige Proben zusätzlich kulturell bestätigt werden mussten.
Die empfehlenswerte Untersuchungskaskade erfüllte die Kriterien für eine Validierung von Verfahren gemäß USDA FSIS-Vorgaben und erwies sich somit als gleichwertig zum Refe-renzverfahren, hinsichtlich der Untersuchungszeit sowie der Vermehrungsfähigkeit des E. coli O157:H7-Referenzstammes sogar als überlegen. Mit der Erhöhung der Probenein-waage konnte die Detektionsgrenze des Erregers auf 0,003 bis 0,008 KbE/g (respektive ein bis drei Zellen pro Probe) gesenkt werden.
Die spezifische Erfassung selbst geringster E. coli O157:H7-Kontaminationen in der Matrix Rindfleisch gelingt mit den hier vorgestellten Screeningverfahren innerhalb eines Tages. Darüber hinaus kann mit diesen die Anzahl weiter zu bestätigender Proben deutlich redu-ziert werden. Eine völlige Freiheit des Lebensmittels Rindfleisch von E. coli O157:H7 kann insbesondere aufgrund der inhomogenen Verteilung nicht garantiert werden. Die in den ei-genen Untersuchungen als bevorzugt einzusetzende Detektionskaskade ermittelte Vorge-hensweise ist gleichwohl geeignet, bei Einbindung in ein kontrolliertes Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP)-System die Voraussetzung für die Gewinnung sicherer Le-bensmittel zu schaffen. E. coli O157:H7 poses a threat in view of food safety for consumers, especially on account of causing severe diseases. An extraordinary low infective dose coincidently inhomogenous distribution in food impose difficult requirements on diagnostic tests. These investigations were focused on the dectection rate of a very low contamination with E. coli O157:H7 in ground beef and beef trim samples. Simultaneously the possibility of reducing the time-to-result by using an alternative method compared to the reference procedure was examined.
As reference method, the United States Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service (FSIS) Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 5.04 was performed. The sample size measured 65 g, followed by enrichment in modified tryptic soy broth with Novobiocin (mTSB+N). For the specific detection of E. coli O157:H7 immunomagnetic sepa-ration (IMS), subculture on modified Rainbow® Agar O157, latex agglutination, biochemical profile, and Duopath® Verotoxins gold labelled immunosorbent assay (GLISA) were applied.
In alternative methodology, 375 g samples were enriched in RapidcultTM E. coli broth, en-sued by IMS, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Singlepath® E. coli O157 GLISA, and cultural confirmation via cefixime tellurite sorbitol-MacConkey (CT-SMAC) agar. Three different sampling points (eight, ten and 22 hours) were compared.
Collectively 240 samples were investigated, belonging to the matrices ground beef (n=108) and beef trims (n=132). After cold stressing E. coli O157:H7 reference strain ATCC 35150, it was inoculated with a total concentration per sample of one to three colony forming units (CFU) for fractional positives respectively 103 CFU for positive controls. For statistical analy-sis, paired and unpaired samples were measured by calculating relative recovery, sensitivi-ty, and specifity. Results were exploited using the intention-to-treat (ITT) and per-protocol (PP) analyses to ascertain comparability relating to validation criteria.
Despite cold-stress and high levels of background flora, the inoculated E. coli O157:H7 strain could be detected reliable from both fractional and positive samples. With both broths, enriching the pathogen to a detectable level was performed successfully. Especially RapidcultTM broth had favourable results showing a satistical higher relative recovery com-pared to mTSB+N. With it´s spezialised trait to enrich the pathogen in shorter time to a de-tectable level compared to reference broth, this new enrichment medium enables to reduce the bottelneck enrichment time significantly from 22 to eight respectively ten hours. Thus, time-to-result receiving a Verotoxin positive isolate could be reduced from five to three days. In both matrices ground beef and beef trim, eight and ten hours enrichment time were dis-tinct as optimal. Using an immunological (Singlepath® E. coli GLISA) and moleculobiological (RT-PCR with foodproof® E. coli O157 Detection Kit 5’ Nucelase) screening test enabled to receive a preliminary result within one workday, followed by cultural confirmation of potential positive samples.
The test setup fulfilled validation criteria for alternative methods according to USDA FSIS standards. The introduced alternative method performed equally as reference procedure, improved regarding time-to-result and enrichment proficiency of E. coli O157:H7 reference strain actually. Increased sample weight led to decreased detection level with 0.003 to 0.008 CFU/g (means one to three CFU per sample).
The specific detection of even lowest E. coli O157:H7 contamination rates from beef worked out successfully with the presented screening methods within one workday. These were used efficiently to reduce quantity of samples to be determined by cultural confirmation. Even lack of E. coli O157:H7 in beef isn´t proofed because of it´s inhomogenous distribu-tion, combining sensitive detection methods with simultaneous involvement in a controlled hazard and analysis critical control point (HACCP) system is basis for gaining safe food.