Untersuchungen zum Übertragungsweg des Parrot Bornavirus 4 am Beispiel des Nymphensittichs (Nymphicus hollandicus)

Aviäre Bornaviren können neben Psittaziden auch andere Vögel wie Kanarien und Wassergeflügel infizieren. Bei Papageien kann es durch das Parrot Bornavirus (PaBV) neben gastrointestinalen Erkrankungen, wie der Psittazinen Drüsenmagendilatation (PDD), auch zu neurologischen Symptomen kommen. PaBV stellt ein weltweites Problem dar, besonders in größeren Zuchtbetrieben oder bei der Erhaltung von bedrohten Arten. Die fäkooronasale Übertragung wurde bislang als natürliche Infektionsroute aviärer Bornaviren vermutet, konnte jedoch bisher nicht belegt werden.

Mit dieser Arbeit sollten die orale und nasale Infektionsroute, sowie die Übertragung über Schleimhaut- und Hautwunden als mögliche Infektionswege des Parrot Bornavirus am Beispiel des Nymphensittichs (Nymphicus hollandicus) als Modelltier untersucht werden.
Dazu wurden spezifisch pathogenfreie (SPF), subadulte Nymphensittiche oral (n = 9), nasal (n = 9), über eine Läsion am Gaumendach (n = 9), bzw. eine Läsion am linken Fußballen (n = 3) mit einem PaBV-4-Isolat mit einem Titer von 103 TCID50, (bzw. 104 TCID50 bei der Fußballen-Gruppe) inokuliert. Eine Mock-Gruppe (n = 2) wurde mit virusfreier Zell-
suspension ebenfalls über eine Gaumenläsion inokuliert und fungierte als Kontrollgruppe. Der Gesundheitszustand aller Tiere wurde über einen Zeitraum von 173/174 Tagen (orale und nasale Gruppe), bzw. 184 Tagen (Gaumendach-Gruppe) und 209 Tagen (Fußballen-Gruppe) beobachtet. Wöchentliche Kropf- und Kloakentupfer sowie Blutproben wurden
untersucht, um eine mögliche PaBV-RNA-Ausscheidung mittels Realtime-RT-PCR und das Auftreten von spezifischen Antikörpern gegen PaBV mittels indirektem Immunfluoreszenztest (iIFT) zu detektieren.
Beim Auftreten von mittelgradigen Krankheitssymptomen bzw. am Versuchsende wurden alle Nymphensittiche euthanasiert und ihre Organe mittels Realtime-RT-PCR auf PaBV-RNA, sowie mittels Histologie auf lymphoplasmazelluläre Infiltrate als Hinweis auf eine PDD und mittels Immunhistochemie auf virales Antigen (p24) untersucht. Eine Virusreisolierung erfolgte aus Gehirn- und Kropfmaterial eines jeden Tieres. Sekundärkrankheiten wie bakterielle Infektionen oder Mykosen des Magen-Darm-Traktes wurden ausgeschlossen.
Innerhalb der oralen und nasalen Gruppen kam es bei 8/18 Tieren zu unspezifischen Symptomen und insgesamt vier Verlusten vor Ende der Versuchszeit, was eventuell auf ein Problem mit dem Filtersystem der Isolatoren und Begleitinfektionen zurückzuführen war.
Bei fünf Tieren der oralen und bei drei der nasalen Gruppe wurde zu Beginn des Versuchs bis zum Tag 34 pi PaBV-RNA in den Tupferproben nachgewiesen. Allerdings wurde in keiner Tupferprobe eines späteren Zeitpunktes innerhalb der oralen und nasalen Gruppe, sowie in keiner Tupferprobe der Gaumendach- und Mock-Gruppe PaBV-RNA nachgewiesen. Ebenso wurde keine PaBV-RNA und kein Virusantigen in den Organen dieser Versuchsgruppen detektiert, weshalb eine produktive Infektion ausgeschlossen werden konnte.
Lediglich bei der Fußballen-Gruppe konnten niedrige PaBV-RNA-Gehalte in den Nn. ischiadici, Darm und Haut, sowie in der Histologie PDD-typische Infiltrate in der Haut von zwei Tieren nachgewiesen werden. Mittels Immunhistochemie wurde in dieser Gruppe das virale Antigen p24 bei allen drei Tieren im Rückenmark bzw. in Spinalganglien sowie in den Nn. ischiadici und in der Haut nachgewiesen. Die schwach positiven Realtime-RT-PCR-Ergebnisse wurden mittels Sequenzierung als PaBV-4 bestätigt, was die erfolgreiche Infektion über diese Route belegt. Bei keinem Versuchstier kam es zu einer Serokonversion oder zu einer PaBV-RNA-Ausscheidung. Auch war bei keinem Tier eine Virusreisolierung erfolgreich. Die Ergebnisse der Fußballen-Gruppe sprechen für eine erfolgreiche Infektion und Verteilung des Parrot Bornavirus im Wirtsorganismus über retrograden, axonalen Transport.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass eine nasale oder orale Aufnahme von 103 TCID50 des PaBV Stammes Ps34 im Versuch nicht als relevante Übertragungsroute fungiert, was sich mit Beobachtungen betroffener Bestände und anderen Infektionsversuchen deckt. Anhand der Ergebnisse der Fußballen-Gruppe wurde belegt, dass Hautläsionen mit Zugang zu Nervenfasern als Eintrittspforte für PaBV dienen können. Es zeigen sich Über-einstimmungen im Übertragungsverhalten zum Mammalian 1 bornavirus und dem Toll-wutvirus, welche beide zu derselben Ordnung der Mononegavirales zählen.
Die Übertragung von PaBV scheint an invasive Routen gebunden zu sein. Diese Daten könnten genutzt werden, um sinnvolle Sanierungs- und Prophylaxe-Maßnahmen von be-troffenen Zuchtbeständen bedrohter Papageienarten zu etablieren. Avian bornaviruses can affect psittacines and other birds like canaries and waterfowl. In parrots, parrot bornavirus (PaBV) can cause gastrointestinal problems, like the Psittacine Dilatation Disease (PDD), as well as neurological signs. PaBV appears to be a worldwide problem, especially in breeding centres or in the conservation of endangered species. Faeco-oral transmission was suspected as the natural way of infection of avian bornaviruses, but could not be proven yet.
This work investigates the oral or nasal route, as well as the application through mucosal and skin lesions operate as a potential route of infection of PaBV in cockatiels (Nymphicus hollandicus) as model species.
For this purpose, specific pathogen free (SPF) subadult cockatiels were inoculated orally (n = 9), nasally (n = 9) and through palatal lesion (n = 9) with a PaBV-4 isolate with a titre of 103 TCID50, as well as through footpad lesion (n = 3) with a titre of 104 TCID50. A mock group (n = 2) was inoculated through palatal lesion with virus-free cell suspension. Health condition of all animals was monitored over a period of 173/174 days (oral and nasal group), 184 days (palatal lesion group) and 209 days (footpad lesion group), respectively. Crop- and cloacal swabs as well as blood samples were investigated weekly and checked for possible PaBV-RNA-shedding with real time RT-PCR and for specific anti-PaBV-antibodies with indirect immunofluorescence assay (iIFA).
In case of the occurrence of moderate clinical signs or at the end of the trial, respectively, all cockatiels were euthanized and their organs were examined for PaBV-RNA with real-time-RT-PCR, for mononuclear cell infiltrations as a hint for PDD through histology as well as for viral antigen (p24) through immunohistochemistry. Virus reisolation was per-formed with brain and crop material of every animal. Secondary diseases like bacterial and mycotic infections of the gastrointestinal tract were excluded.
8/18 birds of the oral and nasal groups showed unspecific clinical signs and four deaths occurred prior to the end of the trial, potentially due to problems with the filter system of the incubators and secondary infections.
PaBV-RNA was detected in the swab samples of five birds of the oral and three of the nasal group at the beginning of the trial up to day 34 pi. No PaBV-RNA was detected in any swab sample took at a later time of the oral or nasal group, as well as in the palatal lesion and mock group. Furthermore, no PaBV-RNA and no viral antigen was found in the organs of these groups. Therefore, a successful infection through these routes can be excluded.
Only the footpad lesion group showed a low amount of PaBV-RNA in Nn. ischiadici, intestine and skin, as well as histologically infiltrations typical for PDD in skin tissue of two animals. Immunohistochemistry revealed the viral antigen p24 in the spinal cord, respectively spinal ganglia of all three animals, as well as in the Nn. ischiadici and skin tissue. The slightly positive real time RT-PCR results were validated as PaBV-4 by sequencing, confirming successful infection via this route. No animal showed serocon-version or PaBV-RNA-shedding. Virus reisolation was not successful for any bird. The
results of the footpad group indicate a successful infection and spread of PaBV in the host through retrograde axonal transport.
The recent data show, that a nasal or oral intake of 103 TCID50 of the PaBV strain Ps34 in this trial cannot be considered as a relevant transmission route, which is supported by ob-servations in affected flocks and other infection trials. The results of the footpad lesions group verify that skin lesions with access to nerve fibres operate as a potential entry portal. This is an alignment of the transmission manner with Mammalian 1 bornavirus and rabies, which all belong to the order Mononegavirales.
The transmission of PaBV seems to be bound to invasive routes. These data could be used to establish reasonable sanitation and prophylaxes for affected breeding stock of endan-gered psittacines.