Analysen zum Metabolismus Cryptosporidium parvum-infizierter Wirtszellen sowie Feldstudien zu C. parvum-Infektionen bei Kälbern und Seekühen

Cryptosporidium parvum ist ein obligat intrazellulärer Protozoe, der Epithelzellen des Dünndarms infiziert und schwere Durchfallerkrankungen bei Mensch und Tier induzieren kann. In seiner Entwicklung ist C. parvum zu weiten Teilen auf die Stoffwechselleistungen seiner Wirtszelle angewiesen, da der Parasit selbst nur über minimale eigene Stoffwechselkapazitäten verfügt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher metabolische Umsatzraten C. parvum-infizierter Wirtszellen untersucht. Dabei wurden vergleichend laborübliche (21% O2 = Hyperoxie) und physiologischerweise im Darm vorherrschende Sauerstoffbedingungen (5% O2 = Physioxie) berücksichtigt, da bekannt ist, dass der Metabolismus einer Zelle über den Sauerstoffpartialdruck beeinflusst wird. Zur Erfassung metabolischer Signaturen infizierter Zellen wurden metabolische Umwandlungsraten von Schlüssel-Stoffwechselsubstraten und -Produkten (Glukose, Pyruvat, Lactat, Glutamin, Glutamat, Serin, Alanin und Aspartat) in den Nährmedium-Überständen von C. parvum-infizierten Zellkultur-Modellen analysiert. Zusammenfassend zeigte sich in C. parvum-infizierten HCT-8-Zellen ein deutlicher Anstieg im Glukose- und Glutaminverbrauch bei gleichzeitig gesteigerter Laktatabgabe. Auf den Entzug von Glutamin im Nährmedium reagierten die C. parvum-infizierten HCT-8 Zellen mit einer weiteren Steigerung im Glucose- und Lactat-Umsatz. Die Glykolyse und die Glutaminolyse sind beides Stoffwechselwege, welche in proliferierenden Zellen sowohl Energie als auch Ausgangstoffe für die Zellbaustein-Synthese liefern. Um die Relevanz der festgestellten Veränderungen in den Stoffwechsel-Umsätzen für die C. parvum Replikation zu überprüfen, wurde der Einfluss von bekannten kommerziell erhältlichen Hemmstoffen ausgewählter Reaktionen dieser Stoffwechselwege auf die C. parvum-Replikation untersucht. Getestet wurden im Detail: Inhibitoren der Glukose-Laktat-Achse [Lonidamin = Inhibitor der Hexokinase, des Mitochondrial Carrier Proteins und der Monocarboxylattransporter (MCT) 1, 2, 4; Galloflavin = Laktatdehydrogenase-Inhibitor; Syrosingopine = MCT1/4-Inhibitor] und ein Inhibitor der Glutaminolyse (Compound 968 = Glutaminase-Inhibitor). In Übereinstimmung mit den zuvor generierten Stoffwechsel-Umsatzraten führten alle Inhibitoren sowohl unter Physioxie als auch unter Hyperoxie zu einer signifikanten Hemmung der Parasiten-Replikation. Diese Ergebnisse bestätigten die Relevanz der Glykolyse und Glutaminolyse, sowie des Laktat-Exports für die C. parvum-Replikation. Um die physiologischen Bedingungen noch realitätsnäher zu simulieren, wurde zusätzlich ein C. parvum-Infektionsmodell unter Verwendung boviner Dünndarmexplantate etabliert und die metabolischen Signaturen infizierter Explantate unter Hyperoxie und Physioxie analysiert. Hier zeigten sich in der frühen Phase der Infektion (3 Stunden p.i.) zunächst verminderte Umsatzraten der wichtigen Schlüsselmetabolite Glukose, Lactat, Pyruvat, Glutamin, Glutamat, Alanin, Serin und Aspartat, welche drei Stunden später – also 6 Stunden p. i.-. zu einer gesteigerten Umsatzrate bei diesen Stoffwechselsubstraten und –produkten wechselten. Untersuchungen zu C. parvum-Infektionen bei ebenso neu etablierten primären bovinen Dündarmepithelzellen (BSIEC) bestätigten die Hochregulation der glykolytischen Reaktionen in der frühen Phase der Merogonie. Eine Hauptkomponentenanalyse enthüllte das sauerstoffabhängige Clustering der metabolischen Umsätze, welches den wichtigen Einfluss des jeweils vorherrschenden Sauerstoffpartialdrucks bestätigt. Da bekannt ist, dass die Zusammensetzung des enteralen Mikrobioms eines Wirtes zum einen den Ausgang einer Kryptosporidiose beeinflussen kann und andererseits Kryptosporidieninfektionen die Mikrobiomdiversität modulieren, wurde in dieser Arbeit zusätzlich eine Feldstudie durchgeführt, bei der die Wirksamkeit von oral verabreichten Hefe-Fermentationsprodukten im Vergleich zu Halofuginongaben bei natürlichen C. parvum-Infektionen von Kälbern überprüft werden sollten. Allerdings zeigte sich, dass beide Behandlungen keinen maßgeblich positiven Effekt bezüglich Oozystenausscheidung, klinischer Symptomatik oder täglichen Zunahmen hatten.
Da der zoonotisch relevante Parasit C. parvum eine Vielzahl von Wirten infizieren und insbesondere über Gewässer übertragen werden kann, wurden in einem letzten Arbeitspaket der vorliegenden Dissertation unterschiedliche Populationen kolumbianischer Seekühe auf ihr Parasitenspektrum untersucht. Dabei konnten diese Tiere nicht als Ausscheider von Kryptosporidien-Oozysten oder Koproantigen identifiziert werden, allerdings zeigte sich ein differenziertes Spektrum spezifischer Parasiteninfektionen in den geographisch unterschiedlich angesiedelten Manati-Populationen. Darunter waren auch mehrere Parasiten-Erstbeschreibungen bei dieser von Ausrottung bedrohten Säugetierspezies. Cryptosporidium parvum is an obligate intracellular protozoan that infects epithelial cells of the small intestine and can induce severe diarrhoeal diseases in humans and animals. In its development, C. parvum is largely dependent on the metabolic performance of its host cell, since the parasite itself has only minimal metabolic capacities of its own. In the present study, metabolic reactions of C. parvum-infected host cells were therefore investigated. Laboratory conditions (21% O2 = hyperoxia) and physiological oxygen conditions prevailing in the intestine (5% O2 = physioxia) were taken into account, since it is known that the metabolism of a cell is significantly influenced by the oxygen partial pressure. To detect metabolic signatures of infected cells, metabolic conversion rates of the key metabolites glucose, lactate, pyruvate, glutamine, glutamate, alanine, serine and aspartate were analysed and metabolic pathways derived from the obtained metabolic data were selectively inhibited to test their relevance for parasite development. In summary, C. parvum-infected HCT-8 cells showed a marked increase in glucose and glutamine consumption with concomitant increased lactate release, indicating both glycolysis and glutaminolysis as important energy-providing pathways for parasite replication. Accordingly, the effect in terms of glucose and lactate was enhanced when cells were cultured under glutamine-minimal conditions. Based on these results, inhibition experiments were carried out using inhibitors of the glucose-lactate axis [lonidamine = inhibitor of hexokinase, mitochondrial carrier protein and monocarboxylate transporters (MCT) 1, 2, 4; galloflavin = lactate dehydrogenase inhibitor; syrosingopine = MCT1/4 inhibitor] as well as glutaminolysis (compound 968 = glutaminase inhibitor). In accordance with the metabolic data obtained, all inhibitors led to a significant inhibition of the parasite under both physioxia and hyperoxia. These data confirmed the relevance of glycoyse and glutaminolysis, but also of lactate export for C. parvum infections.
In order to generate even more realistic data, a C. parvum infection model was additionally established using bovine small intestine explants and metabolic signatures of infected samples were analysed under hyperoxia and physioxia. Here, interestingly, initially decreased turnover rates of the important key metabolites glucose, lactate, pyruvate, glutamine, glutamates, alanine, serines and aspartates were shown early after infection (3 hours p. i.) with a subsequent reversal of the reactions three hours later (6 hours p. i.). Studies on C. parvum infections in equally newly established primary bovine inflammatory epithelial cells (BSIEC) confirmed the upregulation of glycolytic responses in the early phase of merogony. Interestingly, a principal component analysis confirmed an oxygen-dependent clustering of the metabolic data and thus the important influence of the prevailing oxygen partial pressure.
Since it is known that the composition of the enteric microbiome of a host can influence the outcome of cryptosporidiosis on the one hand and that cryptosporidial infections modulate microbiome diversity on the other hand, a field study was additionally conducted in this work to test the efficacy of orally administered yeast fermentation products compared to halofuginone administration in natural C. parvum infections of calves. However, it was found that neither treatment had a significant positive effect on oocyst excretion, clinical symptoms or daily gain.
Since the zoonotically relevant parasite C. parvum can infect a variety of hosts and can be transmitted in particular via water bodies, different populations of Colombian manatees were examined for their parasite spectrum in a final work package of the present dissertation. These animals could not be identified as excretors of cryptosporidial oocysts or coproantigen, but a differentiated spectrum of specific parasite infections was found in the geographically differently located manatee populations. Among them were several first descriptions of parasites in this mammalian species threatened with extinction.