Die Bedeutung der Angiogenese auf die Veränderung der Gefäßarchitektur bei der murinen Leberfibrose

Hauptgegenstand vieler Diskussionen ist die Frage, wie die Angiogenese sowohl die Progression als auch die Regression einer Leberfibrose beeinflusst (Liu et al., 2017; Ackermann et al., 2020; Roehlen et al., 2020). Die vorliegende Studie verfolgt daher das Ziel, die Fragestellung Fibrogenese oder Angiogenese: was war zuerst? genauer zu untersuchen und zu beleuchten. In diesem Zusammenhang soll auf die Bedeutung der Veränderung der Gefäßarchitektur bei der murinen Leberfibrose eingegangen werden. Mittels mikrovaskulärer Gefäßausgüsse untersuchen wir die dreidimensionale Struktur der Gefäßveränderungen. Um Computer-basierte 3D-Darstellungen der Gefäßarchitektur zu gewinnen, wird zudem die µ-Computertomographie genutzt. Als weitere Untersuchungsmöglichkeiten dienen immunhistochemische Verfahren. Hierzu werden drei verschiedene Mausmodelle (CCl4- vs. TAA-Intoxikation vs. Mdr2-Knockout-Modell) genutzt. Die Tiere werden in verschiedene Altersgruppen unterteilt, sodass die Lebern beim CCl4- und TAA-Modell nach drei- und sechswöchiger Intoxikation für die Untersuchungen entnommen werden. Einer dritten Gruppe wird das jeweilige Hepatotoxin sechs Wochen verabreicht und die Lebern nach weiteren drei Wochen ohne Behandlung entnommen, um die Regeneration untersuchen zu können. Die Lebern der Tiere des Mdr2-Knockout-Modells werden nach fünf Wochen, nach 10 und nach 12 Wochen untersucht.
In der vorliegenden Arbeit weisen die Lebern der Tiere im Verlauf der Applikation mit den Hepatotoxinen zunächst mehr Kollagen im Bereich der Periportalfelder und der Zentralvenen auf, als die der Kontrollgruppen. Ähnliche Beobachtungen können wir anhand der Korrosions-Präparate sowie der µ-Computertomographie verzeichnen. Hier zeigt sich die Akkumulation des Kollagens in Form von „leeren“ Stellen zwischen den Gefäßen. Obwohl die Kollagenablagerung zu den Versuchszeitpunkten der Regressionsphase sowie der 12 Wochen alten Tiere im Knockout-Modell wieder abnimmt, können wir eine Zunahme der Dichte der Sinusoide bei beiden noxischen Modellen auch in der Regressionsphase verzeichnen. So steigt die prozentuale Gefäßdichte im Verhältnis zum Schnitt von 52,37% ± 8,61% (sechs Wochen Induktion CCl4) auf 64,42% ± 6,15% (Regressionsgruppe des CCl4-Modells). Gleichzeitig verringert sich die VEGF-Expression in diesem Zeitraum und sinkt von 0,76% VEGF-positiv gefärbter Zellen pro Schnitt auf 0,01%.
Beim Mdr2-Knockout-Modell werden ebenfalls einige widersprechende Ergebnisse in Bezug auf die Kollagenablagerung sowie die Dichte der Sinusoide generiert, wobei diese im Vergleich zu den anderen beiden Modellen nicht so ausgeprägt sind.
In allen Mausmodellen können wir sowohl die intussuszeptive als auch die sprossbildende Angiogenese beobachten, wobei alle Modelle eine signifikant höhere Anzahl an einer Sprossbildung sowohl bei den Kontrollgruppen als auch bei den Fibrose-Tieren aufweisen. So weist die Kontrollgruppe des CCl4-Modells einen Mittelwert von 10,52 ± 4,23 Sprouts und 0,05 ± 0,22 Pillars pro Bildausschnitt auf. Betrachtet man die Veränderungen der Sprouts und Pillars zu Beginn der Fibrose, ist ein signifikanter Anstieg der Pillars mit einsetzender Fibrose sowohl beim CCl4- als auch beim TAA-Modell zu verzeichnen (Abbildung 27, 30). Die Anzahl der Pillars steigt beim CCl4-Modell bei der dreiwöchigen Intoxikation um das 37-fache, wohingegen die Anzahl der Sprouts sogar fällt. Unsere Ergebnisse sprechen dafür, dass die Angiogenese bei einer Leberfibrose, welche scheinbar hauptsächlich in Form der intussuszeptiven Angiogenese erfolgt, eher durch die Primärerkrankung oder die damit verbundene Entzündung fortschreitet, als durch die Fibrogenese selbst.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass es durch das Fortschreiten der Intoxikation und damit verbunden der Fibrose zunehmend zur Ausbildung bindegewebiger Septen und der Einlagerung extrazellulärer Matrix kommt. Dies bewirkt als Reaktion zwangsläufig hämodynamische Veränderungen sowie die Entstehung von Anastomosen. Diese Beobachtungen können wir mit der vorliegenden Studie untermauern. Damit stellen diese Formen der Angiogenese, hier vor allem die intravaskuläre Septierung, eine zentrale adaptive Reaktion auf den kontinuierlich ansteigenden Blutfluss und den damit einhergehenden erhöhten portosystemischen Blutdruck während der Progression sowie Regression einer Leberfibrose dar.

In Bezug auf die Angiogenese und dessen Rolle im Zuge der Fibrose weist auch diese Studie einige widersprüchliche Ergebnisse auf. So kann auch hier nicht mit Sicherheit dargelegt werden, ob die Angiogenese den ersten Promotor in der Signalkaskade der Fibrose darstellt, oder aber für die Regression einer Fibrose verantwortlich ist.
Zudem sollte ein Ausblick darüber gegeben werden, welches Tierversuchsmodell (CCl4 vs. TAA-Intoxikation vs. Mdr2-Knockout-Modell) das geeignetste für das Erproben antifibrotischer Therapiestrategien sowohl der humanen als auch der veterinären Leberfibrose darstellt.
Bezüglich der Fibroseausbildung werden innerhalb der verschiedenen Versuchszeitpunkte signifikante Unterschiede bezüglich des Fibroseausmaßes festgestellt. Das CCl4-Modell zeigt zu allen Zeitpunkten die signifikanteste Fibrose, sodass dieses Modell wohl das geeignetste für die weitere Entwicklung antifibrotischer Therapien darstellt. The main topic of many discussions is how angiogenesis affects both the progression and the regression of liver fibrosis (Liu et al., 2017; Ackermann et al., 2020; Roehlen et al., 2020). The aim of the present study is therefor the question of fibrogenesis or angiogenesis: which was first? investigate and illuminate more closely. In this context, the importance of changing the vascular architecture in murine liver fibrosis will be discussed. Using microvascular outlets, we examine the three-dimensional structure of the vascular changes. In order to obtain computer-based 3D representations of the vascular architecture, µ-computer tomography is also used. Immunohistochemical methods serve as further investigation options. For this purpose, three different mouse models (CCl4- vs. TAA intoxication vs. Mdr2 knockout model) are used. The animals are devided into different age groups so that the livers of the CCl4 and TAA models are removed for the examinations after three and six weeks of intoxication. A third group is given the respective hepatotoxin for six weeks and the livers are removed without treatment after a further three weeks in order to be able to examine the regeneration. The livers of the animals of the Mdr2 knockout model are examined after five weeks, after 10 and after 12 weeks. In the present work, the livers of the animal initially show more collagen around the periportal fields and the central veins than that of the control groups in the course of the application with the hepatotoxins. We can make similar ovservations with the corrosion preparations and the µ-computed tomography.
This shows the accumulation of collagen in the form of “empty” spots between vessels. Although the collagen deposition decreases again during the progression phase and the 12-week-old animals in the knockout model, we can also see an increase in the density of the sinusoids in both noxious models in the regression phase. The percentage of vessel density in relation to the average increases from 52.37% ± 8.61% (six weeks of induction CCl4) to 64.42% ± 6.15% (regression group of the CCl4 model). At the same time, VEGF expression decreases during this period from 0.76% VEGF-positive stained cells per section to 0.01%. The Mdr2 knockout model also generates some conflicting results, although these are not as significant compared to the other two models.
In all mouse models we can observe both intussusceptive and sprouting angiogenesis, with all models showing a significantly higher number of sprouting angiogenesis in both the control groups and the fibrosis animals. The control group of the CCl4 model has a mean value of 10.52 ± 4.23 sprouts and 0.05 ± 0.22 pillars per image section. Looking at the changes in sprouts and pillars at the onset of fibrosis, there was a significant increase in pillars with onset fibrosis in both the CCl4 and TAA models (figures 27, 30). In the CCl4 model, the number of pillars increases 37-fold during the three-week intoxication, while the number of sprouts even falls.
Our results allow the hypothesis that angiogenesis in liver fibrosis, which apparently mainly takes the form of intussusceptive angiogenesis, progresses more through the primary disease or the inflammation associated with it than through fibrogenesis itself.
Conclusionally the progression of the intoxication and the associated fibrosis increasingly lead to the formation of connective tissue septa and the incorporation of extracellular matrix. In response, this inevitably causes hemodynamic changes and the formation of anastomoses. We can support these observations with the present study. These forms of angiogenesis, especially intravascular septation, represent a central adaptive reaction to the continuously increasing blood flow and the associated increased portosystemic blood pressure during the progression and regression of liver fibrosis.

Regarding angiogenesis and its role in the course of fibrosis, this study also has some conflicting results. It cannot be shown with certainty whether angiogenesis is the first promotor in the signaling cascade of fibrosis or whether it is responsible for the regression of fibrosis.

In addition, an outlook should be given on which animal model (CCl4 vs. TAA intoxication vs. Mdr2 knockout model) is the most suitable for testing antifibrotic therapy strategies in both human and verterinary liver fibrosis. Regarding the formation of fibrosis, significant differences in the extent of the fibrosis were found within the various test times. The CCl4 model shows the most significant fibrosis at all times, making this model the most suitable for the further development of antifibrotic therapies.