Transfusion von BNP-Alloantikörper-haltigem Serum auf Kälber mit unterschiedlicher Alloantigen-Reaktivität

In diese Studie wurden insgesamt 50 Kälber einbezogen. Von diesen wurden für die vorliegende Arbeit die Daten von 35 Kälbern aus dem Hauptversuch ausgewertet; die intravenös per Dauertropfinfusion innerhalb von 24 Stunden zugeführte Dosis an BNP- oder Kontrollserum betrug dabei 300 ml / 50kg KM. BNP-Serum erhielten 20 dieser Probanden, wovon 14 Tiere eine positive Alloantikörper-Bindungsreaktivität gegen Leukozyten im DFZM-Allo-AK-Bindungstest und 6 Tiere eine negative Alloantikörper-Bindungsreaktivität gegen Leukozyten im DFZM-Allo-AK-Bindungstest besaßen. Von den 15 Probanden, denen Kontrollserum verabreicht wurde, zeigten 11 Tiere eine positive Alloantikörper-Bindungsreaktivität gegen Leukozyten im DFZM-Allo-AK-Bindungstest und 4 Tiere reagierten diesbezüglich negativ. Darüber hinaus wurden bei den 14 Kälbern mit nachgewiesener positiver Alloantikörper-Bindungsreaktivität gegen Leukozyten und zu transfundierendem BNP-Serum auch deren MHC-I-Reaktivität bestimmt; dabei erwiesen sich acht Tiere hinsichtlich ihrer Allo-AK-Affinität für leukozytäre MHC-I-Moleküle als positiv und sechs Tiere als negativ.
Keines der Kälber verstarb im Verlauf der Studie an der BNP, und keines entwickelte klinische Symptome einer BNP. Jedoch konnten unter diesen klinisch unauffälligen Kälbern einige subklinische BNP-Fälle diagnostiziert werden. Bei neun der 20 mit BNP-Serum infundierten Kälber (45 %) kam es zu einer temporären Thrombozytopenie, bei dreien (15 %) zu einer temporären Leukozytopenie, und 18 dieser Probanden (90 %) entwickelten eine temporäre Lymphozytopenie. Die Unterschiede zwischen den beiden Serumtransfusionsgruppen erwiesen sich hinsichtlich des Verlaufs der Thrombozytenzahlen, der Lymphozytenzahlen sowie bezüglich der Anzahl an eosinophilen und der basophilen Granulozyten als signifikant.
Bezüglich der hämatologischen Befunde ergaben sich keine nachweisbaren Unter-schiede nach Transfusion von BNP-Serum respektive Kontrollserum zwi¬schen den Probanden mit positiver und solchen mit negativer Alloantikörper-Bindungsreaktivität, abgesehen von der Anzahl an eosinophilen Granulozyten, welche in der Gruppe mit negativer Alloantikörper-Bindungsreaktivität signifikant erhöht war, und von der Anzahl an Monozyten, welche in der Gruppe mit positiver Alloantikörper-Bindungsreaktivität signifikant erhöht war.
Ebenso konnten keine hämatologischen Unterschiede zwischen den Kälbern mit zuvor positiv getesteter MHC-I-Bindungsreaktivität und den Kälbern mit zuvor negativ getesteter MHC-I-Bindungsreaktivität gegen Alloantikörper nachgewiesen werden. Auch hier war einzig in der Anzahl der eosinophilen Granulozyten ein signifikanter Unterschied feststellbar.
Auch durch die Verabreichung einer nochmals deutlich erhöhten BNP-Serumdosis aus demselben Serumpool an drei Kälber konnten keine klinischen Anzeichen einer BNP bei den Studientieren hervorgerufen werden. Jedoch entwickelten diese eine subklinische BNP. Verglichen mit den subklinischen BNP-Fällen des Hauptversuchs konnten Unterschiede bezüglich der hämatologischen Parameter festgestellt werden, was auf eine gewisse Dosis-Wirkungsbeziehung hindeutet. Bei der höheren BNP-Serumdosis waren die Thrombozytopenie und Lymphozytopenie ausgeprägter und länger anhaltend. Zudem konnte bei einem dieser drei Kälber ein wesentlich deutlicherer und auffällig längerer Rückgang der Leukozytenzahlen festgestellt werden. Bei zwei Kälbern war die Monozytopenie deutlich ausgeprägter als bei den mit BNP-Serum behandelten Kälbern des Hauptversuchs.
Hinsichtlich der untersuchten Substrate und Proteine, der Serumenzyme, des Gerinnungsprofils und der Elektrolyte konnten keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit der Art des transfundierten Serums nachgewiesen werden.
Bei der Betrachtung des Knochenmarks konnte festgestellt werden, dass in der BNP-Serum-Gruppe signifikant häufiger Zytophagie der Zellen mit anschließender Verminderung der Knochenmarkszellularität auftrat als in der Kontrollserum-Gruppe.

Schlussfolgerungen
Zur Induktion der BNP-typischen klinischen und pathologischen Veränderungen sind offensichtlich deutlich höhere und / oder spezifischere Mengen an Alloantikörpern erforderlich als sie in den hier intravenös zugeführten Serumdosen vorhanden waren. Jedoch führte die Transfusion des Alloantikörper-haltigen Serums teilweise zu hämatologischen Veränderungen, vergleichbar einer subklinischen BNP. Dabei deuteten die Befunde auf einen Zusammen¬hang zwischen den BNP-typischen hämatologischen Veränderungen und der Gesamtdosis an zugeführten Allo¬antikörpern hin. Für den pathogenetischen Effekt sind aber offensichtlich nicht oder nicht allein Alloantikörper gegen bovines MHC-I verantwortlich. Die Ergebnisse schließen daher eine klassische MHC-I-Variante als ur¬sächliches Anti¬gen eher aus. Die unterschiedlichen Auswirkungen auf die im Blut zirkulierenden Zielzellen sowie die deutlichen individuellen Unterschiede könnten dahingehend interpretiert werden, dass zum einen nicht alle kernhaltigen Zellen bzw. deren verschiedene Reifestadien das Zielanti¬gen bzw. die Zielantigene exprimieren und dass offensichtlich selbst innerhalb eines be¬stimmten Zelltyps kein kon¬stantes Expressionsmuster der BNP-Zielantigene existiert. Es ist ebenfalls nicht auszuschließen, dass von den Blutermüttern in unterschiedlichem Umfang mehrere gegen jeweils verschiedene Epitope gerichtete Alloantikörper gebildet werden, was die unterschiedlichen hämatologischen Veränderungen auch bei natürlich aufgetretenen BNP-Fällen erklären könnte. The cause of bovine neonatal pancytopenia (BNP), which was first describes in 2006, is the uptake of colostral alloantibodies, which were formed in genetically predisposed mothers af¬ter vaccination with an inactivated BVDV vaccine (PregSure® BVD, Pfizer GmbH) that was on the market until 2010. In affected calves, the binding of these alloantibodies to platelets, leukocytes and their precursor cells in the bone marrow leads to thrombocytopenia, leukope¬nia and panmyelophthisis, which is often fatal.
In the context of this doctoral thesis, the clinical effects as well as the interindividual re¬sponse of different cell populations and other laboratory parameters to the defined transfu¬sion of serum alloantibodies from "BNP dams" should be investigated in calves in depend¬ence on the alloantibody reactivity of the leukocytes of these calves as well as on their MHC-I genotype. This should contribute to the clarification of the question to which target cells these antibodies bind in the affected calves and which haematological, clinical (haemorrhagic diathesis) and histopathological consequences (bone marrow damage) result from this. In particular, these studies also served to further verify the previously postulated pathogenesis model of a presumed interaction between the MHC-I genotype of PregSure® BVD vac¬cinated mothers and that of their calves and the occurrence of Bovine Neonatal Pancytope¬nia.

Material and Methods
In preparation for the study, serum from 22 BNP dams was stored frozen by -80°C. Serum from the eight cows with the highest alloantibody levels was finally pooled and frozen in ali-quots. For the control calves, the pooled serum of seven cows not vaccinated against BVDV was available, whose calves had proven to be haematologically inconspicuous during regular controls in the first three weeks of life.
For the actual experiment, male Holstein calves were sampled in five dairy herds between the 3rd and 5th day of life and their blood cells were tested for alloantibody reactivity in the DFZM-Allo-AK binding assay. A portion of the samples was further tested for allo-AK affinity of leukocytic MHC-I molecules. Calves included in the study were brought to the Clinic for Ruminants, University of Giessen, on day 7 of life and assigned to different groups according to their reactivity (positive or neg¬ative reaction of leukocytes to alloantibodies or MCH I positive or negative).
Results
A total of 50 calves were included in this study. Of these, data from 35 calves from the main experiment were analyzed for the present work; the dose of BNP or control serum delivered intravenously by continuous drip infusion within 24 hours was 300 ml / 50kg BW. BNP serum was given to 20 of these subjects, of which 14 animals had positive alloantibody binding re-activity to leukocytes in the DFZM-Allo-AK binding assay and 6 animals had negative alloan-tibody binding reactivity to leukocytes in the DFZM-Allo-AK binding assay. Of the 15 test calves administered control serum, 11 animals showed positive alloantibody binding reactiv¬ity against leukocytes in the DFZM-Allo-AK binding assay and 4 animals reacted negatively in this regard. In addition, the 14 calves with demonstrated positive alloantibody binding reac¬tivity against leukocytes and BNP serum to be transfused also had their MHC-I reactivity de¬termined; eight animals were found to be positive and six animals negative with respect to their allo-AK affinity for leukocyte MHC-I molecules.
None of the calves died of BNP during the course of the study, and none developed clinical signs of BNP. However, some subclinical BNP cases were diagnosed among these clinically unsuspicious calves. Nine of the 20 calves infused with BNP serum (45%) developed tempo¬rary thrombocytopenia, three (15%) developed temporary leukocytopenia, and 18 of these claves (90%) developed temporary lymphocytopenia. The differences between the two se¬rum transfusion groups were found to be significant with respect to the course of platelet counts, lymphocyte counts, and eosinophil and basophil granulocyte counts.
With regard to haematological findings, there were no detectable differences after transfusion of BNP serum and control serum, respectively, between the calves with positive and those with negative alloantibody binding reactivity, except for the number of eosinophil granulo¬cytes, which was significantly increased in the group with negative alloantibody binding reac¬tivity, and the number of monocytes, which was significantly increased in the group with posi¬tive alloantibody binding reactivity.
Similarly, no haematological differences could be detected between the calves with previ¬ously positive MHC-I binding reactivity and the calves with previously negative MHC-I binding reactivity to alloantibodies. Again, the only significant difference was in the number of eosino¬phil granulocytes.
Even administration of an significantly increased BNP serum dose from the same serum pool to three calves did not induce clinical signs of BNP in the study animals. However, they did develop subclinical BNP. Compared with the subclinical BNP cases in the main experiment, differences were observed with respect to haematologic parameters, suggesting some dose-response relationship. At the higher BNP serum dose, thrombocytopenia and lymphocytope¬nia were more pronounced and prolonged. In addition, a much more marked and strikingly prolonged decrease in leukocyte counts was noted in one of these three calves. In two calves, monocytopenia was significantly more pronounced than in the calves treated with BNP serum in the main experiment.
With regard to the substrates and proteins examined, serum enzymes, coagulation profile, and electrolytes, no significant differences were detected depending on the type of serum transfused.
When the bone marrow was examined, it was found that cytophagy of cells with subsequent decrease in bone marrow cellularity occurred significantly more frequently in the BNP serum group than in the control serum group.

Conclusions
To induce the clinical and pathological changes typical of BNP, significantly higher and/or more specific amounts of alloantibodies are obviously required than were present in the serum doses administered intravenously here. However, transfusion of the alloantibody-containing serum partially resulted in haematologic changes comparable to subclinical BNP. Thereby, the find¬ings indicated a correlation between the BNP-typical haematologic changes and the total dose of alloantibodies supplied. However, alloantibodies against bovine MHC-I are obviously not or not solely responsible for the pathogenetic effect. Therefore, the results tend to exclude a clas¬sical MHC-I variant as the causative antigene.
The different effects on the target cells circulat¬ing in the blood as well as the clear individual differences could be interpreted to the effect that, on the one hand, not all nucleated cells or their different stages of maturation express the target antigen or target antigens and that obviously no constant expression pattern of the BNP target antigens exists even within a certain cell type. It also cannot be excluded that several alloantibodies directed against different epitopes are produced to different extents by the BNP dams, which could explain the different haematological changes even in naturally occurring BNP cases.