Validierungsstudie eines Point-of-Care Serum Amyloid A Le-segerätes für die Pferdepraxis im Vergleich zu zwei in der Tiermedizin verwendeten Turbidimetrischen Immunoassays

Serum Amyloid A (SAA) ist ein hoch-sensitives und häufig verwendetes Akute-Phase-Protein (APP) zur Verfolgung des Ausmaßes einer entzündlichen oder infektiösen Erkrankung in der Pferdemedizin. Es stehen verschiedene, patienten-nahe Point-of-Care (POC) -Tests und turbidimetrische Immunoassays (TIAs) für die Messung von equinem SAA zur Verfügung. Neben dem humanmedizinischen TIA „LZ-SAA“ gibt es den neuen, tiermedizinischen TIA „VET-SAA“ (beide Eiken Chemical) zur Messung von Pferde-SAA. Bisher gibt es nach aktuellem Stand der Literatur keine Validierungsstudie, welche die Leistung eines POC-Tests mit der Leistung des TIA VET-SAA vergleicht. Außerdem gibt es bisher keine Studien, die den Einfluss möglicher Interferenzen auf POC-SAA-Messergebnisse untersuchen.

Aus diesem Grund waren die Ziele der vorliegenden Studie,
1.)einen methodenübergreifenden Vergleich zwischen dem POC-Lesegerät „StableLab-EQ1-Handheld-Reader“ (SL-EQ1HR) mit den zugehörigen Testkartuschen der Firma StableLab und den beiden zuvor validierten TIAs (LZ-SAA; im Folgenden TIA-A und VET-SAA; im Folgenden TIA-B; beide Eiken Chemical) durchzuführen. Dabei wurden Bias zwischen den Methoden und die Variationskoeffizienten (CV) bestimmt und der beobachtete Gesamtfehler („total observed error“, TEobs) berechnet. Der humanmedizinische TIA (LZ-SAA) diente als Referenzmethode.
2.)Einen geräteinternen Vergleich durchzuführen, welcher die Bestimmung des Einflusses von Interferenzen auf die Testergebnisse sowie die Berechnung der Linearität und der Recovery Rate (RR) umfasste. Zusätzlich wurde das Vorhandensein eines Hook-Effekts und der Einfluss der Lagerung auf die durch den POCA ermittelten SAA-Werte untersucht.

Die Studie erfolgte in zwei Abschnitten: Zwischen März und Dezember 2018 wurde die Validierung des POC versus des Eiken LZ-SAA-Tests durchgeführt. Die Validierung des POC versus des Eiken VET-SAA-Tests erfolgte zwischen Januar und Februar 2021. Nach Begutachtung des Studienaufbaus durch die Ethikkommission des Regierungspräsidiums Gießen wurde die Studie nicht als Tierversuch eingestuft (Vorgangsnummer JLU_kTV_02_2021).
Die analytische Leistung der Tests erfolgte innerhalb drei verschiedener Konzentrationsbereiche und unter dem Einfluss von Interferenzen. Es lag ein signifikanter Unterschied zwischen den medianen SAA-Resultaten vor (p < 0,0001), wobei die stärksten Bias zwischen dem POC- und dem TIA-B-Test gemessen wurde (mediane SAA-Werte 1093 versus 578 µg/ml). Die Übereinstimmung zwischen POC/TIA-A und zwischen POC/TIA-B war mäßig (rs = 0,77 und 0,69) und hervorragend beim Vergleich der beiden TIAs (rs = 0,93). Der Vergleich von POC/TIA-A, POC/TIA-B und TIA-A/TIA-B führte zu folgenden Bias: 56,7 %, 80,9 % und -28,2 %. Die Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten (CVs) der beiden TIAs lagen generell < 12 % und waren somit niedriger als die Intra- und Inter-Assay CVs des POC-Tests (16,1 bis 30 % und 19,8 bis 35,5 %). Während der Zusatz von Intralipid zu einem positiven Bias auf POC- und TIA-B-Resultate führte (35,9 bis 77,4 %), bewirkten Bilirubin und Hämoglobin negative Biases ( -16,6 bis - 45,6 %). Der POC hatte eine gute Linearität bei SAA-Konzentrationen bis zu 10312 µg/ml (R2 = 0,92). Bei SAA-Konzentrationen > 3000 µg/ml kam es zu einem Hook-Effekt innerhalb von POC-Messungen. Equines Serum SAA war über eine mediane Zeitspanne von 2,5 Jahren bei einer Lagerung von – 80 ºC stabil.

Insgesamt konnten die forschungsleitenden Hypothesen dieser Arbeit,
1.)dass ein deutlicher Bias zwischen dem POC-Test und dem humanmedizinischen LZ-SAA-Test und ein noch größerer Bias im Vergleich zwischen POC-Test und VET-SAA-Test besteht;
2.)dass 0,8 g/L Bilirubin, 4 g/L Hämoglobin und 8 g/L Intralipid einen Einfluss auf die Messergebnisse des POC- und TIA-B-Tests haben, wobei Hämoglobin und Bilirubin einen negativen Bias auf SAA-Ergebnisse haben und Intralipid einen positiven Bias auf SAA-Messungen in beiden Fällen bewirkt;
3.)dass bei POC-Messungen von Werten > 3000 µg/ml, welche außerhalb der Leistungsgrenzen des POC-Tests liegen, ein Hook-Effekt beobachtet wird
4.)dass equines SAA bei einer Lagerung bei - 80 °C über einen medianen Lagerungszeitraum von 2,5 Jahren stabil ist
bestätigt werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass POC-, TIA-A- und TIA-B-Ergebnisse nicht direkt vergleichbar sind, da signifikante proportionale Bias beobachtet wurden. Der POC-Test maß generell höhere SAA-Werte als die beiden TIA-Methoden. Die Variation von Antikörper-Kreuzreaktivitäten zwischen verschiedenen Assay-Typen und zwischen Testchargen desselben Assays sowie die heterologe Kalibrierung der TIA-Tests können dabei zur Messung der beobachteten proportionalen Bias beigetragen haben. Der beobachtete Interferenz-Effekt muss bei Pferden mit entsprechenden Krankheitsbildern bedacht werden. Bei SAA-Konzentrationen von > 3000 µg/ml kann es zu einem Hook-Effekt kommen, weshalb Verdünnungen durchgeführt werden sollten, wenn SAA-Wert und klinisches Erscheinungsbild nicht korrelieren. Die Hauptlimitation der vorliegenden Studie ist die variable Lagerungsdauer der Serumproben. Jedoch hatte ein medianer Altersunterschied der Serumproben von 2,5 Jahren keinen Einfluss auf die Serum SAA-Stabilität. Serum Amyloid A (SAA) is a highly sensitive and frequently used acute phase protein (APP) in equine practice to detect inflammatory or infectious processes in horses. Different patient-side point-of-care assays (POC) and turbidimetric immunoassays (TIA) are available on the market for measurement of equine SAA. In addition to the TIA “LZ-SAA” designed for human SAA measurement, the TIA “VET-SAA”, which is designed for veterinary use (both Eiken Chemical), is available for equine SAA measurement. To the author´s best knowledge, there is no validation study comparing POC performance to the novel TIA Eiken VET-SAA to date and studies on the impact of possible interferences on POC SAA results are lacking.

Therefore, the present study aims were:
1.)To perform an inter-method comparison between the POC “StableLab EQ1 handheld reader” with StableLab SAA test cartridges and two previously validated TIAs. The TIAs Eiken LZ-SAA (subsequently named TIA-A) and Eiken VET-SAA (subsequently named TIA-B) were used for comparison with the POC assay and the TIA-A assay acted as reference method. Inter-method comparison included determination of bias between methods and coefficients of variation (CVs) to calculate the total observed error (TEobs).
2.)To perform an intra-method comparison, which included an interference study as well as experiments to assess linearity and recovery. Furthermore, possible Hook effect as well as the impact of storage were investigated.

The study was conducted over a period of several years: Validation of the POC versus the TIA-A assay and of the POC versus the TIA-B assay was performed between March and December 2018 and between January and February 2021, respectively. Ethical approval was given by the Regierungspraesidium Giessen (ethics committee number JLU_kTV_02_2021).
Three different concentration levels and interferences were used to assess analytical performance.
A significant difference between median SAA results (p < 0.0001) with the strongest bias between the POC and TIA-B assay (median 1093 vs. 578 µg/ml) was found during inter-method comparison. There was a fair correlation between POC/TIA-A and between POC/TIA-B (rs = 0.77 and 0.69). Correlation between the two TIAs was excellent (rs = 0.93). Comparisons of POC/TIA-A, POC/TIA-B and TIA-A/TIA-B revealed following biases: 56.7 %, 80.9 %, and - 28.2 % respectively. TIA intra- and inter-assay CVs (generally < 12 %) were lower than POC intra- and inter-assay CVs (16.1 to 30% and 19.8 to 35.5%). While intralipid had a positive bias on POC and TIA-B results (35.9 to 77.4 %), addition of bilirubin and hemoglobin resulted in a negative bias (- 16.6 to - 45.6 %). There was a good POC linearity of SAA concentrations up to 10312 µg/ml (R2 = 0.92). At POC SAA results > 3000 µg/ml, a Hook effect was noticed. When stored at – 80 ºC, over a median period of 2.5 years, equine serum SAA was stable.

Overall, our hypotheses that
1.)there is a significant bias between POC and TIA-A measurements and an even stronger bias between POC and TIA-B measurements;
2.)the addition of 0.8 g/L bilirubin, 4 g/L hemoglobin and 8 g/L intralipid results in detectable interferences on POC and TIA-B results with hemoglobin and bilirubin having a negative bias on SAA results and intralipid having a positive bias on SAA results in both cases;
3.)a Hook effect is observed at POC measurements of equine SAA samples exceeding the original working range of the POC assay of 3000 µg/ml;
4.)that equine serum SAA is stable over 2.5 years of storage at – 80 ºC.
were confirmed

In conclusion, POC, TIA-A and TIA-B results are not directly comparable as significant proportional observed biases were observed and there was a general overestimation of POC results compared to both TIA methods. Variation of antibody cross-reactivity between different assay-typ and between batches of the same assay as well as heterologous TIA calibration can contribute to observed proportional bias. The impact of the investigated interferents must be considered during SAA measurement of horses with according clinical conditions. At POC SAA concentrations > 3000 µg/ml, a possible Hook effect has to be considered if SAA results and clinical presentation of the horse do not correlate. A major limitation of the present study is that it has been conducted over a period of several years. However, median age difference of 2.5 years had no impact on equine serum SAA stability.