Potenzielle Reservoire bei neurotropen Bornavirus-Infektionen

Viele Virusinfektionen und „emerging infectious diseases“ (EID) besitzen ein Reservoir in wildlebenden Tierpopulationen, von der Übertragungen der Infektionserreger auf Haustiere und Menschen stattfinden. Dies stellt eine beträchtliche Gefahr für die öffentliche Gesundheit dar und Tiermodelle, die die Reservoirsituation widerspiegeln, können durch die Erforschung grundlegender Mechanismen Hinweise für zukünftige Bekämpfungstrategien liefern.
Borna disease virus (BoDV-1) ist seit langer Zeit als Erreger der Bornaschen Krankheit (BD) bekannt, einer neurologischen, tödlichen Erkrankung bei Säugetieren, insbesondere bei Pferden und Schafen. Kürzlich wurde auch der zoonotische Charakter von BoDV-1 gezeigt und bisher wurden mehr als 30 humane Todesfälle auf BoDV-1 zurückgeführt.
Die Feldspitzmaus (Crocidura leucodon) wird als Reservoir von BoDV-1 in verschiedenen endemischen Regionen vermutet, da mehrfach Wildfänge mit natürlichen BoDV-1-Infektionen gefunden wurden und das Verteilungsmuster mit Virustranskription und Replikation in Ausscheideorganen auf eine Virusausscheidung hindeutet.
Ziel des ersten Teils der vorliegenden Arbeit war, durch Untersuchungen an lebenden infizierten Feldspitzmäusen die BoDV-1-Infektion im Reservoirtier näher zu charakterisieren. Insbesondere eine Aussage über die Ausscheidung von BoDV-1 durch infizierte Feldspitzmäuse sollte getroffen werden. Zur Erreichung dieses Ziels sollte eine Feldspitzmaushaltung und -zucht etabliert werden, um die Infektion unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Fledermäuse, die aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften häufig als Reservoir für Viren fungieren und bei denen endogene Bornavirus-ähnliche Elemente im Genom verschiedener Arten gefunden wurden, natürliche BoDV-1-Infektionen aufweisen und damit als weiteres Reservoir von BoDV-1 in Frage kommen.
Für den ersten Teil der Arbeit wurden innerhalb von zwei Jahren 16 Feldspitzmäuse an zwei Standorten aus der Natur entnommen und 13 Feldspitzmäuse lebend in die Haltung genommen. Die Bedingungen und Anpassungen der Haltung an die spezifischen Bedürfnisse von Feldspitzmäusen wurden beschrieben und mit den Ansätzen früherer Spitzmaushaltungen verglichen. Innerhalb von 6 Jahren wurden 19 Nachkommen in 3 Generationen gezüchtet. Der Mittelwert der Lebensdauer in der Haltung bei den Wildfängen betrug 810 Tage (91 Tage bis 1353 Tage), der Mittelwert der Lebensdauer der in der Haltung geborenen Spitzmäuse betrug 963 Tage (401 Tage bis 1278 Tage). Die meisten ermittelten Todesursachen beinhalteten Neoplasien, die mit dem hohen Lebensalter in Zusammenhang stehen können. Die erfolgreiche Etablierung der Haltung ermöglichte die weiteren Untersuchungen dieser Arbeit an den Spitzmäusen.
Von den 16 gefangenen Feldspitzmäusen waren 8 zum Zeitpunkt des Fanges mit BoDV-1 infiziert und ermöglichten die Charakterisierung der natürlichen persistenten BoDV-1-Infektion an lebenden Feldspitzmäusen. BoDV-1-infizierte und nicht-infizierte Tiere unterschieden sich weder im Verhalten noch in der Aktivität oder in der Futteraufnahme. Der statistische Vergleich der Körpermasseentwicklung zwischen infizierten und nicht-infizierten Tieren führte zu keinen signifikanten Unterschieden. BoDV-1-infizierte Feldspitzmäuse schieden infektiöse Viren über Speichel, Haut und Urin aus, wie mittels Virusanzucht gezeigt wurde. BoDV-1-RNA wurde mittels RT-PCR in Speichel, Tränenflüssigkeit, Hauttupfer mit Hautsekreten und Hautschuppen, Urin und Kot festgestellt, interessanterweise zusätzlich auch in der Einstreu. Bei der Untersuchung über 4 aufeinanderfolgende Wochen war bei 2 Tieren in einzelnen Urinproben keine BoDV-1-RNA nachzuweisen, dies kann auf eine intermittierende Ausscheidung hinweisen. Die Untersuchung nach mehr als 250 Tagen in der Haltung zeigte, dass auch zu diesem späten Zeitpunkt der Infektion die Ausscheidung über Speichel, Tränenflüssigkeit, Hautsekreten oder Hautschuppen und Urin stattfand. Die postmortale Untersuchung der infizierten Tiere zeigte keine entzündlichen oder degenerativen Veränderungen im Zusammenhang mit der Infektion, mittels Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung konnte Replikation und Transkription des Virus im Nervensystem und in vielen peripheren Organen gezeigt werden und als Ausscheideorgane die Speicheldrüse, die Tränendrüse, die Niere und Harnblase und die Haut mit Talgdrüsen und Epidermis identifiziert werden. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch in der Umgebung der infizierten Spitzmaus BoDV-1-RNA mit der RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Dies und die Ausscheidung über verschiedene Routen kann die Übertragung von Feldspitzmaus zu Feldspitzmaus ermöglichen und damit den Erhalt des Virus in der Reservoirpopulation, gleichzeitig aber auch die Übertragung auf Fehlwirte.
Für den zweiten Teil der Arbeit wurden 6 Betriebe mit vorherigen Fällen von equiner BD exemplarisch auf das Vorkommen von Fledermäusen mittels Begehung und Aufzeichnungen von Ultraschalldetektoren untersucht. Dabei wurden Quartiere und Jagdgebiete von einem Spektrum von Fledermäusen identifiziert, die eine weite Verbreitung in der Gegend besitzen. Die Untersuchung von Gehirnen von Fledermäusen verschiedener Arten aus ganz Deutschland mittels RT-PCR zeigte in 257 Tieren keinen Hinweis auf orthobornavirale RNA. Dabei wurde eine RT-PCR verwendet, die neben BoDV-1 auch andere zu dem Zeitpunkt bekannte Orthobornaviren nachweisen sollte (7 detektierbare Spezies: Mammalian 1 orthobornavirus, Mammalian 2 orthobornavirus, Passeriform 1 orthobornavirus, Passeriform 2 orthobornavirus, Psittaciform 1 orthobornavirus, Psittaciform 2 orthobornavirus, Waterbird 1 orthobornavirus). In der immunhistologischen Untersuchung zum Nachweis von BoDV-1-Phosphoprotein gab es bei 3 von 140 Tieren eine Reaktion in der glatten Muskulatur des Darmes. Eine Reaktion mit bisher unbekannten Bornaviren oder auf translatierte endogene Bornavirus-ähnliche Elemente konnte nicht ausgeschlossen werden.
Zusammengefasst hat diese Arbeit neue Erkenntnisse zur Reservoirsituation von BoDV-1 hervorgebracht. Trotz des Vorkommens von endogenen Bornavirus-ähnlichen Elementen im Genom verschiedener Fledermausarten gibt es keinen Hinweis darauf, dass sich Fledermäuse natürlich mit BoDV-1 infizieren oder eine Rolle als Reservoir für BoDV-1 spielen. Hingegen hat diese Arbeit gezeigt, dass infizierte Feldspitzmäuse persistent infiziert sind und dauerhaft BoDV-1-RNA und infektiöses Virus über verschiedene Routen ausscheiden, und hat damit den Reservoircharakter von Feldspitzmäusen als natürliches Reservoir für BoDV-1 bewiesen. Many virus infections and emerging infectious diseases (EID) have a reservoir in wild animal populations with pathogen transmission to domestic animals and humans. This poses an imminent threat to public health and studies on animal models reflecting the reservoir situation can provide basic mechanisms to improve future control strategies.
For a long time, Borna disease virus (BoDV-1) is known as the aetiologic agent of Borna disease (BD), a fatal neurologic disorder of mammals, that affects especially horses and sheep. Recently, the zoonotic potential of BoDV-1 has been demonstrated and more than 30 human fatalities have been so far traced back to BoDV-1 infections.
Bicoloured white-toothed shrews (Crocidura leucodon) are considered reservoirs of BoDV-1 in various endemic regions, as wild caught shrews with natural BoDV-1 infections have been found several times and the distribution pattern with viral transcription and replication in excretion organs have indicated virus transmission.
The aim of the first part of the study was to further characterize BoDV-1 infection in the reservoir species by carrying out studies on living BoDV-1 infected bicoloured white-toothed shrews. The main research focus was set to find evidence on shedding of virus by BoDV-1 infected shrews. To achieve this goal, a husbandry and breeding colony of C. leucodon was established to investigate the infection under controlled conditions. A second part of the study investigated whether bats, which due to their biological properties often act as a reservoir for viruses and in which endogenous bornavirus-like elements were found in the genome of different species, have natural BoDV-1 infections, and could be considered as an additional reservoir of BoDV-1.
In the first part of the study, sixteen C. leucodon were taken from nature at two sites within two years to found a husbandry with thirteen living bicoloured white-toothed shrews. Conditions and adaptations of the husbandry to the specific needs of C. leucodon were described and compared with the approaches of other shrew holdings. Within six years, 19 offspring were bred in 3 new generations. The mean lifespan of the wild catches was 810 days (91 days to 1353 days), the mean lifespan of the shrews born in the husbandry was 963 days (401 days to 1278 days). Most of the causes of death comprised of neoplasms, which may be related to high age. The successful establishment of the husbandry enabled further observations of this study.
Of the sixteen C. leucodon caught, eight were infected with BoDV-1 at the time of the catch, allowing the characterization of natural persistent BoDV-1 infection in living bicolored white-toothed shrews. Activity and behaviour during day and night light regime and food intake did not differ between infected and non-infected animals. Furthermore, there was no significant difference on relative body mass trend between infected and non-infected animals. As shown by virus cultivation, BoDV-1 infected C. leucodon spread the virus through saliva, skin, and urine. BoDV-1 RNA was detected by RT-PCR in saliva, lacrimal fluid, skin swabs with dander and sebum, urine, and faeces, interestingly also in the litter. For over a period of 4 weeks of monitoring for virus shedding, BoDV-1 RNA was undetectable in single urine samples of 2 animals, which may indicate intermittent excretion. Additional testing after more than 250 days in husbandry revealed virus shedding in saliva, lacrimal fluid, dander and sebum, and urine at this late time point after infection.
The post mortem examination of infected animals showed no inflammatory or degenerative lesions that could be related to BoDV-1 infection. By immunohistochemistry and in-situ hybridisation, virus replication and transcription was demonstrated both in the nervous system and in peripheral organs. Therefore, salivary gland, lacrimal gland, kidney, urinary bladder, and skin with sebaceous glands and epidermis could be identified as organs responsible for transmission. Additionally, BoDV-1 RNA was demonstrated by RT-PCR in the environment of infected shrews. The contaminated environment and virus shedding over different routes can enable shrew-to-shrew transmission and therefore the maintenance in the reservoir population, but also transmission to spillover hosts.
In the second part of the study, the environment of six horse farms with previous cases of BD were examined for the presence of bats by means of inspection and recordings of ultrasound detectors. Roosts and hunting areas of a variety of common European bat species were identified. Additionally, brain samples of 257 bats of different species from Germany were tested by RT-PCR without any evidence of orthobornaviral RNA. The applied RT-PCR-assay was designed to detect BoDV-1 and several other known orthobornaviruses (7 detectable species: Mammalian 1 orthobornavirus, Mammalian 2 orthobornavirus, Passeriform 1 orthobornavirus, Passeriform 2 orthobornavirus, Psittaciform 1 orthobornavirus, Psittaciform 2 orthobornavirus, Waterbird 1 orthobornavirus). Immunohistological examination for the detection of BoDV-1 phosphoprotein revealed a immunoreaction in 3/140 animals in smooth muscle cells of the intestine. A reaction associated with so far unknown bornaviruses or with translated endogenous bornaviral elements could not be excluded.
In summary, this study enlightened the reservoir situation of BoDV-1. Despite the presence of endogenous bornaviral elements in the genome of different bat species, there is no evidence that bats naturally become infected with BoDV-1 or play a role as a reservoir for BoDV-1. However, this study demonstrated the persistent character of BoDV-1 infection in bicoloured white-toothed shrew with long time shedding of BoDV-1 RNA and infectious virus over different routes, thus proving the reservoir character of C. leucodon as a natural reservoir of BoDV-1.