Einfluss bioaktiver Pflanzenlipide auf Kalziumresorptionsmechanismen im Gastrointestinaltrakt von Schafen

Influence of plant bioactive lipid compounds on calcium absorption mechanisms in the gastrointestinal tract of sheep

Stimulation of calcium absorption can counteract hypocalcemia of dairy cows in early lactation. Plant bioactive lipid compounds (PBLC), most notably menthol, are known as agonists for nonselective cation channels of the transient receptor potential (TRP) family and were recently detected in the ruminal epithelium. PBLC acutely stimulated ruminal calcium absorption ex vivo and resulted in higher blood calcium concentrations in cattle in vivo. The present thesis aimed at reproducing the positive menthol-induced effects from cattle in the model animal sheep and, furthermore, at elucidating calcium absorption mechanisms in the gastrointestinal tract. For this purpose, 24 sheep were divided into a control (Kon), PBLC-L and PBLC-H group, which received 0, 80 and 160 mg/d of a blend of menthol-rich PBLC. After four weeks, blood samples were taken from all animals and specific in vivo parameters were analyzed. The ruminal and jejunal epithelium was analyzed for mRNA expression levels of TRPA1, TRPV3, TRPV5-6, and TRPM6-8, as well as claudin (Cldn)1, -2, -3, -4, -7, occludin (Occl), and zonula occludens (ZO)1 and -2. Calcium and fluorescein flux rates as well as electrophysiological properties of rumen and jejunum epithelia were measured in Ussing chambers in the presence and absence of mucosal sodium, and also in the absence of magnesium. Acute changes in calcium flux rates were measured after mucosal application of 50 μM menthol. Menthol-rich PBLC supplementation resulted in a trend for increased blood calcium concentrations. In the rumen, Cldn7 expression increased linearly with increasing PBLC dose, while ZO2 increased quadratically. In the jejunum, TRPA1, TRPV5, TRPV6, Cldn4, and ZO2 tended to decrease linearly with increasing PBLC dose. Significant calcium net absorption occurred in the rumen, whereas the jejunum showed high passive calcium permeability but no net transport. Ruminal calcium net flux rates increased quadratically with PBLC feeding and decreased under sodiumfree mucosal incubation. Ruminal fluorescein flux rates were not affected by feeding. In the jejunum, fluorescein transport decreased in the mucoserosal direction. In the rumen, shortcircuit current increased in both PBLC feeding groups. Acute menthol application stimulated mucoserosal and calcium net flux rates only in the rumen, with higher stimulation responses in both PBLC groups. It can be summarized that calcium transport in the rumen occurs as an active and transcellular process. TRPV3 is most likely significantly involved in this process, which can be stimulated by menthol. Supplementation with menthol-rich PBLC increases transcellular calcium resorption in the rumen and sensitizes it to acute stimulation by menthol. In contrast, both a functional and structural PBLC effect is not detectable in the jejunum at the doses administered. The use of a combination of long-term PBLC supplementation with acute menthol administration around the parturition period appears to be a promising alternative or complement to current hypocalcemia prevention measures, although final evaluation requires studies in cows around the parturition period. Die Stimulation der Kalziumresorption kann der Hypokalzämie von Milchkühen in der Frühlaktation entgegenwirken. Bioaktive Pflanzenlipide (PBLC), allen voran Menthol, sind als Agonisten für nicht-selektive Kationenkanäle aus der transienten receptor potential (TRP)-Familie bekannt und wurden kürzlich im Pansen von Wiederkäuern nachgewiesen. PBLC stimulierten akut die ruminale Kalziumresorption ex vivo und zogen in vivo höhere Blutkalziumkonzentrationen bei Rindern nach sich. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war der Nachweis der Reproduzierbarkeit der positiven mentholinduzierten Effekte vom Rind beim Modelltier Schaf und darüber hinaus die Aufklärung der Kalziumresorptionsmechanismen im Gastrointestinaltrakt. Dazu wurden 24 Schafe in eine Kontroll- (Kon-), PBLC-L- und PBLC-H-Gruppe aufgeteilt, welche 0, 80 und 160 mg/d einer Mischung mentholreicher PBLC erhielten. Nach vier Wochen wurden allen Versuchstieren Blutproben entnommen und auf spezifische In-vivo-Parameter untersucht. Das Epithel des Pansens und Jejunums wurde auf mRNA-Expressionsniveau von TRPA1, TRPV3, TRPV5-6 und TRPM6-8 sowie Claudin (Cldn)1, -2, -3, -4, -7, Occludin (Occl) und Zonula Occludens (ZO)1 und -2 analysiert. Kalzium- und Fluoresceinfluxraten und die elektrophysiologischen Eigenschaften von Pansen- und Jejunumepithelien wurden in Ussing-Kammern in An- und Abwesenheit von mukosalem Natrium sowie in Abwesenheit von Magnesium gemessen. Akute Veränderungen der Kalziumfluxraten wurden nach mukosaler Applikation von 50 μM Menthol gemessen. Die mentholreiche PBLC-Supplementierung resultierte in einem Trend zu erhöhten Kalziumblutkonzentrationen. Im Pansen stieg die Cldn7-Expression mit steigender PBLC-Dosis linear, während ZO2 quadratisch anstieg. Im Jejunum tendierten TRPA1, TRPV5, TRPV6, Cldn4 und ZO2 mit zunehmender PBLC-Dosis dazu, linear abzunehmen. Im Pansen kam es zu einer Kalziumnettoabsorption, während das Jejunum eine hohe passive Kalziumpermeabilität, aber keinen Nettotransport zeigte. Die Kalziumnettofluxraten im Pansen stiegen mit der PBLC-Fütterung quadratisch an und verringerten sich unter natriumfreier mukosaler Inkubation. Die Fluoresceinfluxraten im Pansen wurden nicht von der Fütterung beeinflusst. Im Jejunum verminderte sich der Fluoresceintransport in mukoserosale Richtung. Im Pansen stieg der Stromfluss in beiden PBLC-Fütterungsgruppen an. Die akute Mentholapplikation stimulierte die mukoserosale Kalziumfluxraten lediglich im Pansen, wobei die Stimulation beider PBLC-Gruppen höher ausfiel. Es lässt sich zusammenfassen, dass der Kalziumtransport im Pansen als aktiver und transzellulärer Prozess abläuft. Dabei ist höchstwahrscheinlich der durch Menthol stimulierbare TRPV3 maßgeblich beteiligt. Die Supplementierung mit mentholreichen PBLC erhöht die transzelluläre Kalziumresorption im Pansen und sensibilisiert diese für eine akute Stimulation durch Menthol. Im Gegensatz dazu ist sowohl ein funktioneller als auch struktureller PBLC-Effekt in den verabreichten Dosierungen im Jejunum nicht nachweisbar. Der Einsatz einer Kombination aus PBLC-Langzeitsupplementierung mit akuter Mentholgabe um den Geburtszeitraum erscheint als vielversprechende Alternative oder Ergänzung zu den gängigen Hypokalzämiepräventionsmaßnahmen. Eine abschließende Beurteilung erfordert weitere Untersuchungen an Kühen um den Geburtszeitraum.