Neuronale Differenzierung caniner mesenchymaler Stammzellen aus dem Fettgewebe über den Zwischenschritt der Bildung dreidimensionaler Sphären

Der Einsatz regenerativer Therapien und insbesondere eine Nutzung von cMSCs zur Behandlung neurologischer Erkrankungen des Hundes ist sehr vielversprechend. Dennoch ist die genaue Rolle, welche cMSCs während des Heilungsprozesses innehaben könnten, bisher weitestgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern cMSCs nach einer erfolgten neuronalen Differenzierung neuronale Eigen¬schaften aufweisen. Dazu wurde in einem Zwischen¬schritt die Bildung dreidimensionaler Sphären, welche Neurosphären imitieren sollten, angeregt. Bei den verwendeten Diffe-renzierungsmedien erfolgte eine starke Orientierung an denen, welche zur Kultivierung caniner neuronaler Zellen verwendet werden. Dies und der Zwischenschritt einer Sphärenbildung sollten ein möglichst physiologisches Milieu zur Dif¬fe¬renzierung der Zellen schaffen.
Dazu wurden cMSCs aus dem Fettgewebe gewonnen und nach ihrer erfolgreichen Charakterisierung in einem neuronalen Prädifferenzierungsmedium, bestehend aus Basismedium, Supplementen und Wachs¬tumsfaktoren, für 3 Tage zur Sphärenbildung angeregt. Als Basismedium wurde DMEM/F-12 verwendet, bei den genutzten Supplementen handelte es sich um N2 und B-27 und als Wachstumsfaktoren wurden EGF und bFGF hinzugegeben. Versuchsweise erfolgte ein Zusatz von Natrium-Heparin. Der fehlende Zusatz von Serum und eine antiadhäsive Ober¬flächen¬beschichtung waren entscheidend für die Sphäreninduktion. Es erfolgte eine Untersuchung der Sphären hingehend ihrer Morphologie und Vitalität. Hierdurch sollte ein Vergleich mit Neurosphären ermöglicht werden. Durch die Analyse metrischer Aspekte wurde der Einfluss verschiedener Medienkomponenten auf die Sphärenbildung beurteilt.
Anschließend erfolgte die siebentägige neuronale Weiterdifferenzierung der Sphären. Dazu wurden diese in Weiterdifferenzierungsmedium auf einer adhäsiven Oberfläche kultiviert. Das Medium setzte sich aus dem gleichen Basismedium und Supplementen zusammen. Außerdem erfolgte eine Zugabe von 2,5 % FKS und die Wachstumsfaktoren wurden durch die Neuro¬trophine NGF und BDNF ersetzt. Der FKS-Zusatz und die Kultivierung der Sphären auf einer adhäsiven Oberfläche waren entscheiden für das Anwachsen und Auswandern der Zellen. Im Anschluss erfolgte eine morphologische Beurteilung der Zellen.
Undifferenzierte cMSCs, Sphären und cMSCs nach viertägiger und siebentägiger Weiter-dif¬fe¬ren¬zie¬rung wurden mittels RT-qPCR, Immunfluoreszenz und Western Blot hingehend ihrer Expression neuronaler Marker untersucht.

Im Folgenden sind die relevanten Ergebnisse aufgeführt:
-Eine effektive Sphärenbildung erfolgte nur, sofern Silikonpads als antiadhäsive Ober¬fläche verwendet wurden.
-Ein Zusatz von FKS während der Prädifferenzierung führte zum Anwachsen der cMSCs auf den Silikonpads.
-Die Zugabe unterschiedlicher Supplemente hatte keinen großen Einfluss auf Größe oder Anzahl der Sphären.
-Sphärengröße und Zellzahl wiesen eine positive Korrelation zueinander auf.
-Besonders in den ersten 48 Stunden fand eine Proliferation der Sphären statt.
-Die Sphären waren vital, proliferierten und wiesen nur einen geringen Anteil toter Zellen auf.
-Die Sphären wiesen ultrastrukturelle Ähnlichkeiten zu Neurosphären auf.
-Eine Adhäsion der Sphären und die Auswanderung von Zellen erfolgte mit Zugabe von 2,5 % FKS und auf einer mit Agarose beschichteten Oberfläche.
-Die neuronal weiterdifferenzierten MSCs wiesen eine unterschiedliche Morpho¬logie auf, welche sowohl auf eine neuronale, als auch auf eine gliale Dif¬fe¬ren¬zie¬rung hindeutete. Wenige Spender zeigten eine Rückkehr zur Stammzellen-ähnlichen Morphologie.
-Die in der RT-qPCR untersuchten neuronalen Marker zeigten auch bei den undiffe-ren¬zierten cMSCs eine basale Expression.
-Es gab Hinweise darauf, dass eine Nestinexpression ein Merkmal multipotenter Progenitorzellen ist und auf eine erhöhte Zellproliferation hinweist. Die Rolle Nestins als Marker neuronaler Vorläuferzellen rückt damit weiter in den Hinter-grund.
-Bei der Untersuchung der Expression der neuronalen Marker konnten Hinweise auf eine beginnende neuronale Differenzierung der Zellen gefunden werden. Es ist wahr¬scheinlich, dass während der Weiterdifferenzierung eine Verdrängung der sich in die neuronale Richtung entwickelnden Zellen durch glial differenzierende Zellen statt¬fand. Dennoch gab es Hinweise, dass teilweise eine weitergehende neuronale Differenzierung weniger Zellen erfolgte. Häufig traten Diskrepanzen zwischen den Ergebnissen der Immunfluoreszenz und der RT-qPCR auf, welche wahrscheinlich auf eine Verminde¬rung der Genexpression bei hohem Vor¬kom¬men des Proteins innerhalb der Zelle zurückzuführen waren.
Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit, dass die differenzierten cMSCs durchaus Hinweise auf eine beginnende und fortschreitende neuronale Differenzierung aufweisen. Dabei sind größere interindividuelle Unterschiede auffällig. Weiterhin ist zu beachten, dass am siebten Tag der Weiterdifferenzierung vermutlich eine Verdrängung durch glial-differenzierende Zellen erfolg¬te, da wenig MAP2-positive Zellen mit Fortsätzen zu beobachten waren und die Mehrzahl der Zellen A2B5-positiv war. Die Sphären bestätigen durch ihre ultrastrukturelle Morphologie, Ergebnisse der Vitalitätstests und Expression von Nestin und β-III Tubulin den proliferativen Neurosphären-ähnlichen Charakter. Es ist jedoch anzumerken, dass bei der alleinigen Unter¬suchung der Expression bestimmter neuronaler Marker einige Aspekte der neuronalen Identitiät wie beispielsweise ihre Aktivität außer Acht gelassen werden. Fraglich ist weiterhin, ob eine vollständige Diffe¬renzierung der cMSCs zu spezifischen Neuronentypen, die ein bestimmtes, sie umgebendes, Mikromilieu benötigen, möglich ist. Jedoch wird dies für die therapeutische Verwendung der Zellen nicht nötig sein, da die Applikation undifferenzierter bzw. vor¬dif¬fe¬ren¬zierter Zellen wahrscheinlich einige Vorteile mit sich bringt. Außerdem wird in Zukunft vorraussichtlich die Rolle der MSCs als immunmodulatrisch wirkende „medicinal signaling cells“, welche die Regeneration geschädigter Gewebe unterstützen, im Vordergrund stehen.
In der Arbeit wurde weiterhin eine Methode entwickelt cMSCs durch Kultivierung auf Silikonpads zur Bildung drei¬dimensionaler Sphären anzuregen. Die Silikonpads stellen eine einfache und sehr effektive Möglichkeit dar, die Zellen in einer 3D-Kultur zu halten und könnten künftig auch bei der Kultivierung anderer Zellen von Nutzen sein. The application of regenerative therapies and especially cMSCs (canine Mesenchymal Stem Cells) holds great promise as treatment option of neurological diseases in canines. Nevertheless, the exact contribution of cMSCs concerning the recovery process still remains nearly unclear. In the present work it was investigated whether cMSCs possess neurological features following differentiation in this direction. On this basis, the generation of threedimensional spheres was induced in an intermediate stage prior to a final differentiation step. Formation of spheres should mimic the developement of neurospheres. The composition of the applied differentiation medium strongly corresponds to media which are used for cultivation of canine neuronal cells. This and the intermediate step of sphere-formation should create a roughly physiological milieu.
CMSCs were isolated from adipose tissue and subsequent to an effective characterisation the sphere-formation was initiated. During this neuronal pre-differentiation step cMSCS were cultured for three days in pre-diffententiation medium consisting of basic medium (DMEM/F-12), supplements (N2 and B-27) and growth factors (bFGF and EGF). On a trial basis the addition of heparin sodium was implemented. A crucial requirement for successful sphere-formation was the cultivation on an anti-adhesive surface in serum free medium. The spheres were investigated concerning their morphology and vitality to facilitate a comparision to neurospheres. The impact of different media compositions on sphere-formation was tested by metrical analyses like the number of cells per sphere and the amount and size of generated spheres.
Subsequently to the generation of spheres during pre-differentiation further neuronal differentiation was induced. To achieve this, the spheres were cultivated in differentiation medium on an adhesive surface for seven days. The medium contained the same basic medium and supplements as applied in the pre-differentiaion medium. Furthermore, 2.5 % fetal bovine serum (FBS) were added and growth factors were substituted by the neurotrophins NGF and BDNF. For attachement of spheres and migration of cells out of them the addition of FBS and cultivation on an adhesive surface were essential. After the final differentiation step the morphology of cells was assessed.
Undifferentiated cMSCs, spheres and cMSCs after four and seven days of further differentiation were analysed by RT-qPCR, immunofluorescence and western blot concerning their expression of neuronal markers.

In the following, the most relevant results are listed:
-The effective generation of spheres was only achieved if silicon pads were applied as anti-adhesive surface.
-An addition of FBS during pre-differentiation led to an attachement of spheres on the silicon pads.
-The addition of different supplements had no impact on the size or number of spheres.
-There was a positive correlation between the size of a sphere and its amount of cells.
-Proliferation of spheres took place especially during the first 48 hours of pre-differentiation.
-Spheres were vital, proliferating and contained only a very few dead cells.
-The spheres showed ultrastructural similarities to neurospheres.
-For adhesion of spheres and cell migration the addition of 2.5 % FBS and an adhesive surface couting with agarose were essential.
-After seven days of final neuronal differentiation the cells showed various morphology, which indicated that a beginning neuronal and glial differentiation took place.
-In the RT-qPCR analysed neuronal markers were also expressed by undifferentiated cells.
-There where remarks that expression of nestin was a feature of multipotent progenitor cells and suggested an enhanced cell proliferation. Thus, the role of nestin as a marker for neuronal progenitor cells is losing importance.
-The analysis of neuronal markers showed indications for a beginning neuronal differentiatin of cMSCs. It is possible that during differentiation a suppression of cells which are differentiating towards the neuronal direction by glial differentiating cells took place. Nevertheless, the positive signal for MAP2 in a few cells indicated ongoing neuronal differentiation. Frequently, discrepancies between results of RT-qPCR and immunofluorescences could be determined. These disparities might be explained by reduction of gene expression when there is a high degree of the protein inside the cell.
Finally, it was shown that the neuronal differentiated cMSCs revealed suggestions for a beginning and proceeding neuronal differentiation. In the course of this interindiviual differences between the donors were conspicuous. On day seven during the final differentiation step a few MAP2-positive cells with processes could be observed, but the majority of cells showed a positive signal for A2B5. Thus, it is plausible that glial differenciating cells were suppressing the cells which were differentiating in the neuronal direction during proceeding neuronal differentiation. Furthermore, the ultrastructural morphology, vitality and positive signal for nestin and β-III tubulin of spheres confirmed their proliferative neurosphere-like character. However, it is notable that the exclusive investigation of neuronal marker expression takes no account of other facets of neuronal identity like neural activity or the release of specific neurotransmitters. It is still questionable whether a complete differentiation of cMSCs into specific types of neurons, which need a special microenvironment, is possible. Nevertheless, this would not be required for therapeutical application of cMSCs, because application of undifferentiated and pre-differentiatied cells might have some advantages. In the future the role of MSCs as immunomodulatory operating “medicinal signaling cell” which supports regeneration of damaged tissues probably will be paramount.
Incidentially, a new method for induction of sphere-formation on silicon-pads was developed. Silicon-Pads are an easy and very effective possibility to culture cMSCs in a threedimensional manner. In the future this method could be useful for other applications, whenever a 3D-culture of cells is desired.