Entwicklung eines monoklonalen Sandwich-ELISA zur direkten Detektion von Blauzungenvirus in infizierten Tieren

Die Blauzungenkrankheit (Bluetongue disease, BT) ist eine anzeigepflichtige virale Infektionskrankheit bei Wiederkäuern und kann bei betroffenen Tieren zu schweren Krankheiten bis hin zu Todesfällen und damit zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen führen. Zum direkten Nachweis des BT Virus (BTV) sind derzeit verschiedene real-time RT PCR-Kits zugelassen. Ein indirekter Nachweis von BTV spezifischen Antikörpern erfolgt über kompetitive ELISA Verfahren.
In der vorliegenden Doktorarbeit sollte ein rekombinanter rein monoklonaler Sandwich-ELISA zur direkten Detektion von BTV-8 Viruspartikeln im infizierten Tier hergestellt werden. Mittels der Phage-Display-Technologie konnten durch Selektion auf aufgereinigten Viruspartikel drei einzigartige humane BTV-8 spezifische scFv-Antikörperfragmente aus den humanen Tomlinson-Bibliotheken I und J isoliert werden.
Nach Konvertierung der scFv-Antikörper in BTV-8 Fab-Fragmente und BTV-8 scFv-Fc-Antikörper-Fusionsproteine konnten die Sandwich-ELISAs gegen
BTV-8 Viruspartikel etabliert werden. Hierzu wurden als Fängerantikörper die entsprechenden BTV-8 Fab-Fragmente eingesetzt. Als Detektionsantikörper wurden die BTV-8 scFv-Fc-Fusionsproteine verwendet. Die BTV-8 Sandwich-ELISAs können sowohl aufgereinigte BTV-8 Viruspartikel, als auch BTV-8 Viruspartikel im Serum eines infizierten Schafes detektieren.
Die Nachweisgrenze (LOD) der BTV-8 Sandwich-ELISAs liegt bei 104 bzw. bei 105 infektiöse BTV-8 TCID50. Weitere Tests des BTV-8 Sandwich-ELISAs auf Viruspartikel der Serogruppen BTV-1, BTV-4, BTV-16 ergab, dass keine der untersuchten BTV Serogruppen, außer der BTV-8 Serogruppe detektiert wurden. Dies zeigt, dass dieser BTV-8 Sandwich-ELISA hochspezifisch BT 8 Viruspartikel erkennt.
Die in dieser Arbeit entwickelten BTV-8 Sandwich ELISAs eignen sich zum sicheren Direktnachweis von BTV-8 Viruspartikeln. Somit steht ein weiteres Testsystem für den direkten Nachweis des Blauzungenvirus zur Verfügung. The bluetongue disease (BT) is a notifiable viral infectious disease in ruminants and can lead to serious diseases or even fatality in affected animals resulting in substantial economic losses. Various real-time RT PCR kits are currently approved for the direct detection of BT virus. An indirect detection of BTV-specific antibodies is carried out by means of competitive ELISA methods.
In the present doctoral thesis, a recombinant purely monoclonal sandwich ELISA for the direct detection of BTV-8 virus particles in the infected animal was to be produced. Using phage display technology, three unique human BTV-8 specific scFv antibody fragments were isolated from the human Tomlinson libraries I and J by selection on purified virus particles.
After conversion of the scFv antibodies into BTV-8 Fab fragments and BTV-8 scFv-Fc antibody fusion proteins, the sandwich ELISA against BTV-8 virus particles could be established. The corresponding BTV-8 Fab fragments were used as capture antibodies. The BTV-8 scFv-Fc fusion proteins were used as detection antibodies. The BTV-8 sandwich ELISA can detect both purified BTV-8 virus particles and BTV-8 virus particles in the serum of an infected sheep.
The detection limit (LOD) of the BTV-8 sandwich ELISA is 104 and / or 105 infectious BTV-8 TCID50. Further testing of the BTV-8 sandwich ELISA for virus particles of the serogroups BTV-1, BTV-4, BTV-16 revealed that none of the examined BTV serogroups were detected except for the BTV-8 serogroup. This shows that this BTV-8 sandwich ELISA detects BT 8 virus particles in a highly specific way.
The BTV-8 sandwich ELISA developed in this work are suitable for the reliable direct detection of BTV-8 virus particles. This provides another test system for the direct detection of bluetongue virus.