Identifikation und molekulare Charakterisierung hoch-immunogener mykobakterieller T-Zell-Antigene

Die Tuberkulose des Menschen stellt die Gesundheitssysteme in aller Welt wegen ihrer weiten Verbreitung und Häufigkeit sowie wegen der zunehmenden Antibiotikaresistenz ihrer Erreger vor immense Heraus¬forderun¬gen. Zur Entwicklung effektiverer Bekämp¬fungs¬-strategien bedarf es neuer Ansätze, unter anderem auch bei der Immun¬diagnostik und bei der Immunprophylaxe. Viele immunologische Grund¬lagen der Tuberkulose sind aber noch immer unverstanden.
Die vorliegende Dissertation verfolgte das Ziel, Bestandteile von Mykobakterien des Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-Komplex (MTK) zu identifizieren, die sowohl bei mit Bacillus-Calmette-Guérin (BCG) immunisierten Personen oder mit Mtb-infizierten Menschen als auch bei BCG-vakzinierten Meerschweinchen prominente T-Zell-Antworten auslösen.
In einem ersten Schritt wurden mononukleäre Leukozyten aus dem peripheren Blut (PBMCs) einer Tuberkulin-reaktiven Person dazu verwendet, um daraus T-Zell-Klone zu etablieren. Aus etablierten 14 Zelllinien wurde ein T-Zell-Klon (B2-T-Zell-Klon) ausgewählt, der stabil zu kultivieren war und der in Anwesenheit von autologen, antigenpräsentierenden Zellen (APCs) auf mykobakterielle Antigenpräparate reproduzierbar und besonders stark mit der Sezernierung von IFN-γ reagierte. Diese messtechnische Anordnung (B2-T-Zell-Stimulation mit nachfolgender Quantifizierung von IFN-γ im Reaktionsansatz mittels ELISA) war die Grund¬¬lage, um die Eigenschaften des für die Stimulation der B2-T-Zellen ursächlichen Antigens (B2-Antigen) näher zu charakterisieren und es chromato¬grafisch aufzureinigen.
Durch Proteinase K-Verdau oder eine milde Verseifung mit Natronlauge ließ sich die Reaktivität des Klons stark reduzieren. Der Klon reagierte auf mykobakterielle Chloroform-Methanol-Extrakte, wobei die Reaktion auf Antigenpräparate von MTK-Mykobakterien beschränkt blieb. Präparate von MOTT führten nicht zu einer Stimulation des T-Zell-Klons. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Präsentation des B2-Antigens MHC-II-vermittelt ist. Des Weiteren wurde bewiesen, dass das Antigen von metabolisch-aktiven Mykobakterien freigesetzt wird, da der T-Zell-Klon bei niedriger Bakterienlast zwar auf lebende, jedoch nicht auf metabolisch-inaktivierte Mykobakterien reagierte. Mit unterschiedlichen Antigenpräparaten, z.B. filtriertem Kulturüberstand, konnte dieser Befund bestätigt werden. Das Antigen lässt sich in Bakterien-Lysaten nachweisen und ist Bestandteil von Tuberkulin.
In einem zweiten Schritt wurden flüssigchromatographische Trennverfahren entwickelt, um das Antigen aus komplexen Bakteriengemischen aufzureinigen. Mittels zweidimensionaler Säulenchromatographie, basierend auf einer initialen Normalphase, die von einer Umkehrphase-Chromatographie gefolgt wurde, gelang es reproduzierbar, das Antigen in wenigen Elutionsfraktionen zu konzentrieren. Dieser Bereich, in dem das vom T-Zell-Klon erkannte Antigen eluiert, erwies sich auch bei einer Ex-vivo-Testung von T-Zellen BCG-immunisierter Meerschweinchen als besonders reaktogen. Die stärkste Ex-vivo-T-Zell-Antwort wurde in der Fraktion beobachtet, die auch den T-Zell-Klon am stärksten stimulierte. Damit ist belegt, dass das vom T-Zell-Klon erkannte Antigen einer Klasse von mykobakteriellen Bestandteilen angehört, die sich biochemisch ähnlich verhalten und hoch-immunogen sind.
Durch die Analyse der biologisch relevanten Fraktionen mittels LC-IMSE-MS konnten über achtzig mykobakterielle Proteine identifiziert werden. Durch Korrelation der T-Zell-Reaktivität mit dem Vorkommen der jeweiligen Antigene konnte diese Vielzahl auf eine Auswahl von sechs Antigenkandidaten eingeengt werden. Bei keinem der sechs Antigenkandidaten ergab sich bislang ein Hinweis darauf, dass es sich um ein Lipopeptid handelt. Allerdings sind alle sechs Kandidaten relativ klein (5,6 kDa bis 15,5 kDa) und weisen einen relativ niedrigen isoelektrischen Punkt (4,96 bis 5,75) auf. Durch Verwendung synthetischer Peptide wird zu zeigen sein, ob eines der sechs Proteine tatsächlich vom T-Zell-Klon erkannt wird und worin die Besonderheit dieser Antigene besteht.