Untersuchungen zum Vorkommen von Salmonella Saintpaul und Campylobacter spp. bei Nutzgeflügelbeständen und weiterführende Untersuchungen der gefundenen Isolate

"Investigations on the occurence of Salmonella Saintpaul and Campylobacter spp. in poultry stocks and further investigations of the detected isolates"

The aim of this study was the evaluation of the samples, which were sent to the Institut für Geflügelkrankheiten of the Freie Universität Berlin from 2008 – 2011 because of statutory Salmonella investigation of poultry flocks. Further investigations were done with isolated Salmonella Saintpaul, which are one of the most often isolated serovars in turkeys. In 2013, S. Saintpaul has been the most often isolated serovar in fattening turkeys in the EU.
Also in this study, it was the most often isolated serovar in fattening turkeys from 2008 to 2010. In 2011 it was at 4th place after S. Infantis, S. Coeln and S. Typhimurium. S. Saintpaul can be a human pathogen and is frequently isolated from poultry meat samples, which is why we took a closer look at this serovar.
For further discrimation of the isolates a pulsed-field-gel-electrophoresis (PFGE) protocol was established. A total of 74 S. Saintpaul isolates were examined by PFGE, of which 67 isoaltes originated from fattening turkeys and seven from laying hens. Moreover 62 of the 74 isolates were tested for antimicrobial resistance. The resistance profiles were also used for discrimination. They widely matched with manual and computer analysis of the PFGE patterns.
Isolates matched from 35 – 100%, at which matching was higher the shorter the time between the sampling periods was.. Furthermore, there was a very high matching inbetween isolates from day-old-chicks over a timespan of four weeks, which were isolated from several flocks in Germany. This is most likely linked to the same origin of the chicks from the same breeder herds or via horizontal transmission at the hatchery. Unfortunately, the origin of the chicks in this study was unknown. We also found a very high match of isolates from day-oldchicks and laying hens. This indicates a common source of infection (i.e. wild birds, trucks, flock visitors, feed, etc.), what will not be solved without further investigation.
Another aim of this study was the attempt to isolate Campylobacter spp. from the samples sent to us due to statutory Salmonella investigation of poultry stocks. Till now there is no statutory provision for diagnosis of Campylobacter spp. in poultry stocks so we further investigated the method used in this study by other procedures.
First we performed isolation like in ISO 10727/2006 described, but instead of 10 ml of the Salmonella-preenrichement we only used 1 ml to not disturb the Salmonella diagnostics. We only found a prevalence of 18,1% in fattening turkeys and 9,4% in chickens. In fattening turkeys considerably more C. jejuni than C. coli were isolated, whereas in laying hens, it was more C. coli. This correlates to what was reported in the published literature. The very low prevalence instead contradicts the literature, why the isolation method was further checked.
Therefore we established a qantitative multiplex Realtime-Polymerase chain reaction (Multiplex qPCR). We investigated retained samples of the Salmonella preenrichement for the existence of Campylobacter-DNA. Here in 58,9% of the turkey samples and 96,3% of the laying hen samples Campylobacter-DNA was found. This is correlates to the literature.
It was noticed that the isolation results were worse the warmer the outside temperature had been. So we conducted storage trials to simulate the usual postal transportation of the Salmonella samples. Therefore, in the first trial we stored two different types of boot swabs for 30 Minutes, one day, two days, three days, four days and five days at different temperatures. Those swabs were scaled right after sampling and before testing to determine the weight loss. This weight loss was equalized with fluid loss. The weight loss unsurprisingly was higher the warmer the outside temperatures had been. We took a second standardized trial where we contaminated fecal samples of a negative laying hen flock with Campylobacter colonies and put the same amount of feces we found in trial one on the boot swabs. The swabs were again stored and investigated like in trial one.
The trials showed that the postal transportation is really disadvantageous for the isolation of Campylobacter spp. because of the oxidative stress for the bacteria, especially at high outside temperatures. A cooled transport to the laboratory is mandatory. If the cooling chain can be maintained the transportation can also endure longer than one day without compromising the isolation outcome.
Overall the isolation of Campylobacter spp. from the sent samples is not suitable for routine diagnostics. The Multiplex qPCR could be a reasonable alternative because of the rapidness of the method and the very low detection limit of Campylobacter-DNA. In addition in this study we further discriminated 54 C. jejuni isolates via sequencing of the Short Variable Region of the Flagellin A Gene (flaA-SVR). This showed a host specific as well as geographic relatedness. There was no time related relation. Ziele der vorliegenden Arbeit waren zum einen die Auswertung der im Institut für Geflügelkrankheiten der FU Berlin im Rahmen des gesetzlich vorgeschriebenen Monitorings eingesandten Salmonellenproben aus Nutzgeflügelbeständen in den Jahren 2008 bis 2011. Weitergehende Untersuchungen fanden mit gefundenen S. Saintpaul statt, die bei Puten zu den am häufigsten isolierten Serovaren zählen. 2013 stand S. Saintpaul EU-weit sogar an der Spitze aller Isolate bei Mastputen.
Auch in der vorliegenden Arbeit war es 2008 bis 2010 das am häufigsten isolierte Serovar bei Mastputen, während es 2011 nur noch an vierter Stelle nach S. Infantis, S. Coeln und S. Typhimurium lag. Da S. Saintpaul humanpathogen sein kann und immer wieder auch in Geflügelfleischproben nachgewiesen wird, wurde in der vorliegenden Arbeit besonders dieses Serovar untersucht.
Zur genaueren Untersuchung der Isolate wurde zum einen ein Pulsfeld-Gelelektrophorese-Protokoll (PFGE-Protokoll) etabliert. Vierundsiebzig S. Saintpaul-Isolate wurden mittels PFGE untersucht und die entstandenen Banden sowohl manuell aus auch mittels Computerprogramm ausgewertet. Außerdem wurden 62 der 74 untersuchten Isolate auf Antibiotikaresistenzen untersucht. Die hierbei entstandenen Resistenzprofile wurden ebenfalls zur Differenzierung genutzt und stimmten sowohl mit der manuellen Auswertung als auch mit der Auswertung per Computerprogramm größtenteils überein.
Es zeigte sich eine Übereinstimmung der Isolate von 35 – 100%, wobei die Übereinstimmung höher war, je weniger Zeit zwischen den Funden lag. Außerdem fand sich eine hohe Übereinstimmung von Isolaten von Kükenwindeln über einen Zeitraum von vier Wochen, die aus verschiedenen Beständen Deutschlands isoliert wurden. Dies liegt wahrscheinlich an einer gemeinsamen Herkunft der Küken aus der selben Elterntierherde oder der selben Brüterei, wobei die genaue Herkunft der Küken in der vorliegenden Arbeit nicht bekannt ist. Auch finden sich sehr hohe Übereinstimmungen bei Isolaten von Kükenwindeln und solchen von Legehennen. Hier gibt es wahrscheinlich eine andere gemeinsame Infektionsquelle (Wildvögel, Lastwagen, Stallbesucher, Futter, oder ähnliches), was aber ohne weitere Untersuchungen nicht geklärt werden kann.
Weiteres Ziel der Arbeit war der Versuch, Campylobacter spp. aus den zur gesetzlich vorgeschriebenen Salmonellendiagnostik eingesandten Proben zu isolieren. Da es bisher keine gesetzliche Vorgabe zur Campylobacterdiagnostik gibt, wurde außerdem die Methode mittels weiterer Verfahren untersucht.
Zunächst wurde die Isolierung wie in ISO 10727/2006 beschrieben untersucht. Allerdings wurde anstatt 10 ml der Salmonellenvoranreicherung nur 1 ml verwendet, um die Salmonellendiagnostik nicht zu stören. Es konnte lediglich eine Prävalenz von 18,1 % bei Puten und 9,4 % bei Hühnern festgestellt werden. Bei Puten wurde deutlich häufiger C. jejuni als C. coli isoliert, bei Legehennen kam häufiger C. coli vor. Dies ist auch in der Literatur zu finden. Die geringe Prävalenz jedoch widerspricht den in der Literatur gefundenen Werten, weswegen die Untersuchungsmethode überprüft wurde.
Es wurde eine Multiplex Realtime-Polymerasekettenreaktion (Multiplex qPCR) etabliert. Mit dieser wurden Rückstellproben der Salmonellenvoranreicherung auf das Vorhandensein von Campylobacter-DNA untersucht. Hierbei fand sich in 58,9% der Proben von Puten und 96,3% der Proben von Hühnern Campylobacter-DNA. Dies entspricht auch den in der Literatur genannten Werten.
Es fiel auf, dass die Isolierungsergebnisse schlechter waren, je wärmer die Außentemperaturen waren. Es wurden also im Anschluss Aufbewahrungsversuche durchgeführt, um den üblichen Postversand der zur Salmonellendiagnostik eingesandten Proben zu simulieren. Hierzu wurden im ersten Versuch natürlich kontaminierte Sockentupfer zwei verschiedener Sockentupfertypen nach 30 Minuten, einem Tag, zwei Tagen, drei Tagen, vier Tagen und fünf Tagen bei unterschiedlichen Lagerungstemperaturen untersucht. Diese wurden zusätzlich nach der Probennahme und vor der Untersuchung gewogen, um die hängen gebliebene Kotmenge und den Gewichtsverlust während der Lagerung zu bestimmen. Der Gewichtsverlust wurde mit dem Verlust an Flüssigkeit gleich gesetzt. Der Gewichtsverlust war erwartungsgemäß höher bei höheren Außentemperaturen. Es wurde ein zweiter standardisierter Versuch unternommen. In diesem wurde Kot eines negativen Legehennenbestandes mit einer definierten Menge an Campylobacter-Kolonien beimpft und auf den Sockentupfern verteilt. Sie wurden erneut gelagert und wie im ersten Versuch untersucht.
Es zeigte sich, dass der Versand per Post sehr ungünstig für die Isolierung von Campylobacter spp. ist, da gerade bei höheren Temperaturen der oxidative Stress für die empfindlichen Keime zu hoch ist. Es empfiehlt sich also ein gekühlter Transport ins Labor. Wenn die Kühlkette aufrecht erhalten werden kann, kann dieser Transport auch länger als 24 h dauern, ohne die Isolierungsergebnisse stark zu beeinträchtigen.
Insgesamt ist die Isolierung von Campylobacter spp. aus den eingesandten Proben für die Routinediagnostik nicht geeignet. Die Multiplex qPCR könnte wegen der Schnelligkeit der Methode und der sehr geringen Nachweisrate von Campylobacter-DNA eine sinnvolle Alternative sein.
Des weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit eine diskrimative Untersuchung von 54 C. jejuni-Isolaten mittels Sequenzierung der Short Variable Region des Flagellin A-Genes (flaA-SVR) durchgeführt. Hierbei zeigte sich zum einen sowohl eine wirtsspezifische als auch geographische Nähe. Ein zeitlicher Zusammenhang zwischen den Isolaten bestand nicht.