Untersuchung der Rolle von Lipocalin-2 bei viral-induzierten neuroinflammatorischen Prozessen am Beispiel BoDV-1-infizierter TNF-α-transgener undTNFR-knockout-Mäuse

Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisierung der Rolle von Lipocalin-2 bei immunpa-thologischen Prozessen nach neurotroper Virusinfektion – in diesem Fall nach BoDV-1-Infektion. Durch die Untersuchung verschiedener Mauslinien mit jeweils spezifischen Verän-derungen im TNF-System sollten insbesondere Zusammenhänge zwischen TNF-α und Lcn2 beleuchtet und die mögliche Funktion von Lcn2 in der Entstehung epileptiformer Krämpfe herausgearbeitet werden.
Die Gehirne nicht-, mock- oder neonatal BoDV-1-infizierter Mäuse von Wildtyp-, TNF-α-transgenen, TNFR1-k.o-. und TNFR2-k.o.-Mäusen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mittels immunhistologischer Untersuchung und In-Situ-Hybridisierung im Hinblick auf die Lcn2-Expression ausgewertet. Lipocalin-2 war ausschließlich in der Gruppe BoDV-1-infizierter TNF-α-transgener Tiere sowie bei BoDV-1-infizierten vorzeitig verstorbenen bzw. euthanasierten TNFR1- oder TNFR2-k.o.-Tieren nachweisbar, bei denen epileptiforme Krämpfe beobachtet oder vermutet wurden.
Die Lipocalin-2-Expression erfolgte bei BoDV-1-infizierten TNF-α-transgenen Mäusen ab dem 42. Tag post infectionem und war auf Gehirnareale mit entzündlichen Veränderungen, insbesondere das Striatum, aber auch den Frontalkortex und Hippocampus beschränkt. Die Expression von Lcn2 war assoziiert mit in vorigen Arbeiten beschriebenen neuroinflammato-rischen Prozessen [sowie hohen TNF-α- und insbesondere TNFR1-Spiegeln (HIRZ, 2017; KRAMER et al., 2012; SCHAUDIEN, 2007)]. Lipocalin-2 wurde insbesondere von hypertro-phen Astrozyten in der Nähe perivaskulärer Infiltrate exprimiert. Der mRNA-Nachweis für Lcn2-spezifische Sequenzen verifizierte die Astrozyten als Quelle der Lcn2-Synthese. Lipo-calin-2 war ferner in aktivierten Mikrogliazellen und extrazellulär im Neuroparenchym nach-weisbar. In der Literatur wird dieses parenchymale Lcn2 als sezerniertes Lipocalin-2 be-zeichnet (IP et al., 2011; NOCON et al., 2014).
Ein Teil der BoDV-1-infizierten TNFR1- bzw. TNFR2-k.o-Tiere mit vermutetem Krampfge-schehen zeigte ein den TNF-α-transgenen Tieren ähnelndes Bild der Lcn2-Expression, das durch Lcn2-positive Astrozyten in der Nähe perivaskulärer Entzündungszellinfiltrate gekenn-zeichnet war. Diese Tiere wiesen laut HIRZ (2017) die stärksten entzündlichen Veränderun-gen in dieser Gruppe auf. Im Gegensatz zu den TNF-α-transgenen Mäusen war Lcn2 bei diesen Tieren neben dem Striatum, Frontalkortex und Hippocampus auch im Thalamus zu finden sowie in einem größeren Anteil aktivierter Mikrogliazellen, Ependymzellen der Hirn-ventrikel und meningealen Zellen nachweisbar. Sämtliche verstorbene bzw. euthanasierte Tiere wiesen Lcn2-positive Endothelzellen in Blutgefäßen sämtlicher Hirnareale auf. Sezer-niertes Lcn2 sowie Lcn2-mRNA waren nicht detektierbar. Die Diskrepanz im Lcn2-Expressionsmuster der Tiere mit vermutetem Krampfgeschehen im Vergleich zu den TNF-α-transgenen Tieren kann auf ein anderes Stadium der Neuroinflammation hinweisen.
Die Lcn2-Expression von Astrozyten wurde weiter in vitro an Kulturen der verschiedenen Mauslinien untersucht. Diese wurden nicht bzw. BoDV-1-infiziert und anschließend über einen Zeitraum von 28 Tagen wöchentlich passagiert und durch eine Immunfluoreszenz-Tripelmarkierung auf Lcn2, GFAP und BoDV-1-N untersucht. Lipocalin-2 war bei den Astro-zytenkulturen aller Mauslinien unabhängig des Infektionsstatus über den gesamten Untersu-chungszeitraum nachweisbar. Dies könnte auf den reaktiven Phänotyp kultivierter Astrozyten zurückzuführen sein, der in der Literatur beschrieben ist (AHLEMEYER et al., 2013). Die Kulturen der TNF-α-transgenen Mäuse wiesen die meisten Lcn2-positiven Astrozyten auf. Es ist von einem indirekten Effekt der neuronalen TNF-α-Überexpression auf die Lcn2-Synthese durch eine proinflammatorische Präkonditionierung der Astrozyten auszugehen. Die BoDV-1-Infektion der Astrozyten beeinflusste – trotz der insgesamt geringen Infektionsrate – die Zahl Lcn2-positiver Astrozyten ebenfalls positiv.
Die Stimulation der Astrozyten durch TNF-α induzierte in den Kulturen der Wildtyp- und TNF-α-transgenen Mäuse eine deutliche und vergleichbar hohe Aufregulation von Lcn2, nicht je-doch bei den TNFR1-k.o.-und TNFR2-k.o.-Astrozyten. Die TNFR1-Verfügbarkeit könnte für die gesteigerte Lcn2-Expression von entscheidender Bedeutung sein und sollte in weiteren Arbeiten untersucht werden. Die fehlende Reaktion der TNFR2-k.o.-Astrozyten auf den TNF-α-Stimulus war auf der Hypothese der TNF-α-induzierten, TNFR1-vermittelten Lcn2-Synthese nicht erklärbar. Die BoDV-1-Infektion hatte lediglich einen geringen Einfluss auf die Lcn2-Expression nach TNF-α-Behandlung. Der proinflammatorische Stimulus durch LPS und IFN-γ führte in sämtlichen Astrozytenkulturen – unabhängig vom Infektionsstatus – zu einer fulminanten Lcn2-Expression, die auf TNF-α-unabhängige Signalwege, zum Beispiel über die Aktivierung von PRRs zurückzuführen sein muss. Die antiinflammatorische Wirkung der IL-4-Behandlung war lediglich tendenziell in den Wildtyp- und TNF-α-transgenen Kulturen – unabhängig vom Infektionsstatus – als Reduktion der Zahl Lcn2-positiver Astrozyten erkenn-bar.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die enge Verknüpfung von proinflammatorischen und prokonvulsiven Prozessen und der Expression von Lipocalin-2 in vivo und vitro auf.
Das Expressionsmuster von Lcn2 in den BoDV-1-infizierten TNF-α-transgenen Mäusen weist auf eine TNF-α-induzierte, TNFR1-vermittelte Aufregulation in diesem Modell hin und unter-stützt den vermuteten synergistischen Effekt von TNF-α und BoDV-1. In vitro stellte sich TNF-α ebenfalls als Trigger der astrozytären TNFR1-abhängigen Aufregulation von Lcn2 dar, die aber auch durch andere proinflammatorische Stimuli, hier LPS und IFN-γ, erreicht wurde. Die starke Lcn2-Expression durch hypertrophe Astrozyten in vivo lässt eine regulierende Rolle der Zellen im Entzündungsgeschehen vermuten und lenkt den Fokus auf die weitere Charakterisierung des funktionellen Phänotyps dieser Zellen.
Eine Aufregulation von Lcn2 im Kontext epileptiformer Krämpfe – hier bei den TNFR1- bzw. TNFR2-k.o.-Tieren mit vermutetem oder bestätigtem Krampfgeschehen – konnte gezeigt werden. Grundsätzlich entsprachen die Gehirnareale mit der stärksten Lcn2-Expression den Arealen mit veränderten Expressionsprofilen der Glutamattransporter (HIRZ, 2017).
Inwiefern Lcn2 proinflammatorische und prokonvulsive Effekte induzieren kann, sollte, z.B. mit Hilfe von BoDV-1-infizierten TNF-α-transgenen Lcn2-k.o.-Mäusen und/oder Lcn2-Stimuli an kultivierten Astrozyten, weiter untersucht werden.