Die Analyse der karzinoembryonalen Antigen- und schwangerschaftsspezifischen Glykoprotein-Genfamilie des Pferdes

"The analysis of the carcinoembryonic antigen and pregnancy specific glycoprotein gene family of the horse"

A well-regulated immune reaction is built upon the coordination of the single cells from the innate and the acquired immune system. Next to secreted molecules like cytokines and chemokines such a reaction is mainly mediated by surface molecules belonging to different receptor families found within the leucocyte receptor complex. Beside the well-known and analyzed families like the KIR- or the LIR-family, the CEA gene family belongs to them. This family is embedded within the extended region of the leucocyte receptor complex and is characterized for different mammalian species in a more or less large amount. In the genome of the horse clues for the existence of members belonging to the CEA gene family could be found and their availability was later experimentally proven. While the extension of this family is well examined in other species, like the human and in rodent species, for example mouse and rat, for horses such things are relatively unknown. Based on genome analyzations, partly confirmed during a bachelor thesis (Aleksic, 2010), it could be assumed that in the horse the expression of this family contain quite a few members, among which also secreted members are. Such secreted members are also known from other species developing a haemochorial placenta, in most cases the location where they are expressed, and are referred to as PSGs. In distinction to them the horse is building an epitheliochorial placentation in which the fetomaternal contact is marginally, except for the region of the endometrial cups, where a situation quite similar to this of the haemochorial placenta could be found. This specific members were already well characterized by the group of Robert Kammerer (Aleksic et al, 2016). There was a special eyemark on the membrane-anchored members of this family during the here presented research.
Another characteristic of this CEA gene family is the expression of signaling motives by an ITIM or ITAM localized in their cytoplasmatic tail. Hints for the development of such kind of motives are also apparent in the equine CEA gene family. The expression for two of the ITIM-receptor bearing members of the horse, CEACAM1 and CEACAM43 is already proven whereas the detected splice variations are yet known from the mouse. The remaining members meant to bear an ITIM or ITAM in their cytoplasmatic part, seemed to have lost this signaling motives. After sequence analyzing of this members in neither of this expressed versions of the CEACAMs a signaling motive could be detected.
Therefor some extraordinary motives like a special repetitive sequence could be characterized as an extracellular part of the CEACAM54, still present in the sequence of the finally expressed gene. Expression studies over a generation of a fusion protein de facto expression of this gene could be confirmed.
The only ITAM bearing member of the CEA genes in the horse, the CEACAM41, lost this motive based on the results here. In all of the here detected splice variations the loss of the transmembrane domain suggest a secreted molecule. In other characterized species, like the dog, where ITAM-bearing CEACAMs can be detected, this signaling motives are preserved and in difference to the horse rather duplicated.
Diverse from other species the expression pattern from the secreted PSG-like CEACAMs of the horse is not limited to the placental tissue but instead an increased expression upon the immunological cells and especially on the t-lymphocyte subpopulation was detected. The immunological importance of this secreted equine CEACAMs is underlined by the fact, that some members, like the CEACAM55, which is exclusively expressed upon CD4-positive T-cell, are only expressed on a particular subpopulation of the lymphocytes. Within the subpopulation of the t-cells helper cells can be located, which mediate a well-regulated immune reaction.

Outlook
Lymphocytes and especially some of their subsets like the CD4-positive T-helper cells are mediating a regulated immune response. The here identified population of secreted PSG in the horse like CEACAMs in this part of the activated lymphocytes could play a pivotal role in this regulation mechanism. Because in contrast to the cytokines and chemokines they are much more stable and can facilitate immunological communication between cells over a long distance in the body.
Upon this thought the here presented work is the basis for further research on this field. In other species hemophilic and heterophilic interactions between members of the CEA gene family were shown. Such an interaction as well as correlations and interactions of the different members of the CEACAMs have not been proven for horses so far and need to be done. Eine wohlgeordnete Immunreaktion verlangt eine Koordination zwischen den einzelnen Zellen des angeborenen und erworbenen Immunsystems, was neben den sezernierten Molekülen, wie den Zytokinen und Chemokinen, über Oberflächenmoleküle der verschiedenen Rezeptorfamilien vor allem auch aus dem Bereich des Leukozyten-Rezeptor-Komplexes vermittelt wird. Neben den weitreichend bekannten und analysierten Familien, wie der KIR- oder der LIR-Familie, zählt dazu auch die CEA-Genfamilie. Diese befindet sich im erweiterten Bereich des LRCs und ist bei verschiedenen Säugerspezies bereits in mehr oder weniger großem Umfang nachgewiesen. Auch im Genom des Pferdes konnten Hinweise auf Mitglieder dieser Genfamilie gefunden und später auch experimentell ihr Vorhandensein bestätigt werden. Während bei anderen Spezies, wie dem Menschen oder den Nagerspezies Maus und Ratte, die Ausdehnung dieser Familie schon eingehend untersucht wurden, ist über diese beim Pferd noch nicht allzu viel bekannt. Aus Genomanalysen, die zum Teil im Rahmen einer Bachelorarbeit (Aleksic, 2010) bestätigt wurden, lässt sich vermuten, dass diese Genfamilie auch beim Pferd relativ viele Mitglieder umfasst, unter denen sich auch sezernierte Mitglieder befinden. Solche sezernierten Mitglieder werden auch als PSGs bezeichnet und sind bislang nur von Spezies mit einer hämochorialen Plazenta bekannt, wo auch in den meisten Fällen ihr Expressionsort liegt. Das Pferd hingegen bildet eine epitheliochoriale Plazenta aus, bei der der feto-maternale Kontakt nur marginal besteht, bis auf den Bereich der Endometrial Cups, wo sich eine, der hämochorialen Plazenta nicht unähnliche Situation finden lässt. Diese Mitglieder wurden bereits von der AG Kammerer (Aleksic et al, 2016) genauer untersucht, weshalb im Rahmen dieser Arbeit spezielles Augenmerk auf membranverankerte Mitglieder gelegt wurde.
Eine weitere Besonderheit der CEA-Genfamilie ist die Ausbildung von Signalmotiven in Form eines ITIM- oder ITAM-Motivs. Auch bei den membranverankerten Mitgliedern der equinen CEA-Familie lassen sich Hinweise auf die Ausprägung solcher Rezeptormotive finden. Von den zwei ITIM-haltigen Rezeptoren CEACAM1 und CEACAM43 konnte die Expression in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden, wobei Spleißvarianten entdeckt wurden, die bereits von der Maus bekannt waren. Die restlichen equinen Mitglieder der CEA-Genfamilie, die nach Genomanalysen ein ITIM oder ITAM im zytoplasmatischen Anteil tragen sollten, haben dieses Signalmotiv allem Anschein nach verloren. Bei keinem dieser CEACAMs konnte nach Sequenzanalysen noch ein Signalmotiv im exprimierten Gen nachgewiesen werden.
Dafür konnten außergewöhnliche Motive, wie eine spezielle, repetitive Sequenz im extrazellulären Anteil des CEACAM54 als tatsächlich im fertigen Gen vorhandene Sequenz bestätigt werden. In ersten Expressionsstudien über die Generierung von Fusionsproteinen konnte nachgewiesen werden, dass diese speziellen Gene tatsächlich exprimierbar sind.
Der einzige equine CEA-Vertreter mit einem vorhergesagten ITAM-Motiv, das CEACAM41, hat dieses nach den hier gefundenen Ergebnissen verloren. Die einzigen nachweisbaren exprimierten Spleißvarianten deuten auf Grund des Fehlens der Transmembrandomäne auf ein lösliches Molekül hin. In anderen Spezies, wie dem Hund, in denen ITAM-Motive in der CEACAMs nachgewiesen wurden, blieben diese erhalten und wurden im Gegensatz zum Pferd sogar eher dupliziert.
Anders als von anderen Spezies bekannt, ist das Expressionsmuster der sezernierten PSG-ähnlichen CEACAMs, nicht auf die Plazenta beschränkt, sondern weist im Gegenteil eine erhöhte Expression auf den Immunzellen, speziell den aktivierten T-Lymphozyten auf. Die immunologische Bedeutung dieser löslichen CEACAMs im Pferd wird noch durch die Tatsache unterstrichen, dass einige lösliche Mitglieder nur auf bestimmten Lymphozytenklassen exprimiert werden, wie das CEACAM55, dass auf den CD4-positiven
T-Zellen spezifisch nachgewiesen werden kann. Diese Subklasse stellt auch die T-Helferzellen, die eine geordnete Immunreaktion ermöglichen.

Ausblick
Lymphozyten, speziell einige Subklassen, wie die CD4-positiven T-Helferzellen koordinieren eine regulierte Immunantwort. Die im Pferd nachgewiesene Population von sezernierten, PSG-ähnlichen CEACAMs in dem Anteil der aktivierten Lymphozyten könnten eine entscheidende Rolle in diesem Regulationsmechanismus spielen, da sie im Gegensatz zu Zytokinen und Chemokinen deutlich stabiler sind und so Kommunikation der Immunzellen auch über weite Strecken im Körper ermöglichen.
Mit diesem Gedanken bildet die hier vorliegende Arbeit eine Grundlage für weitere Forschung auf diesem Gebiet. Die für einige Mitglieder dieser Genfamilie in anderen Spezies bereits nachgewiesenen homophilen und heterophilen Interaktionen müssten für die CEA-Mitglieder im Pferd noch nachgewiesen, sowie die damit beeinflussten Zusammenhänge und Wechselwirkungen der einzelnen Mitglieder in diesem Netzwerk untereinander überprüft werden.