Etablierung von Nachweismethoden für Neutrophil Extracellular Traps beim Hund aus Vollblutproben

NETs wurden erst vor einigen Jahren entdeckt und sind ein angeborener Abwehrmechanismus des Körpers, der mittlerweile bei einer Vielzahl von Lebewesen nachvollzogen werden konnte. Es handelt sich dabei um netzartige Strukturen, die von Abwehrzellen des Blutes – v. a. den Neutrophilen Granulozyten – gebildet werden können. Das Grundgerüst dieser Netze besteht aus DNA, die je nach NETose-Form aus dem Nukleus der Zelle oder auch aus den Mitochondrien stammen kann. Dieses DNA-Geflecht ist mit einer Vielzahl von Proteinen aus zytoplasmatischen Granula oder dem Zellkern gespickt. Der initial entdeckte Prozess geht mit dem Tod der Zelle einher. Nach weiteren Jahren der Forschung wurde jedoch immer deutlicher, dass es sehr viele verschiedene Varianten der NETose gibt und hiervon bei weitem nicht alle mit einem Zelluntergang einhergehen. Die Aufgabe dieser Strukturen ist das Fangen und Zerstören von eindringenden Mikroorganismen. Dieser Vorgang verhindert die Streuung von Erregern im Körper und schützt ihn vor gefährlichen systemischen Infektionen. Neben diesem physiologischen Mechanismus kann es jedoch auch zu pathologischen Prozessen kommen. Eine übermäßige NET-Produktion kann mit respiratorischen Erkrankungen, Gerinnungsstörungen, autoimmunen Erkrankungen und, in schweren Fällen, einer Sepsis auch mit einem Multiorganversagen einhergehen.
Ziel der Studie
Da die NETs eben diese pathologischen Folgen haben können und zudem sehr gut als Entzündungsmarker genutzt werden könnten, war es das Ziel der vorliegenden Studie, die Detektion und auch Quantifikation dieser Strukturen mittels des Hämatologiegeräts ADVIA 2120® der Firma Siemens Healthcare zu verwirklichen.
Material und Methoden
Um dieses Ziel zu erreichen, mussten zuerst Vergleichsmethoden zur Darstellung der NETs entwickelt werden. Hierfür wurden Techniken, die bereits in der Literatur beschrieben worden waren, getestet und überprüft, ob sie sich für das gewünschte Vorhaben eignen. Zudem mussten verschiedene Stimulantien getestet werden, da die Etablierung der Methoden zuerst an stimulierten Proben geschehen musste. Auch die Eignung der zwei am häufigsten genutzten Antikoagulantien (EDTA und Heparin) wurde evaluiert, indem die Untersuchungen während der Methodenetablierung stets parallel für beide Stoffe stattfanden. Die Proben hierfür stammten von gesunden Hunden, die aufgrund eines Gesundheitschecks in der Klinik für Kleintiere – Innere Medizin vorstellig wurden.
Die Techniken, die für den Nachweis der NETs getestet wurden, waren die Quantifizierung der DNA mithilfe des Farbstoffes PicoGreen® der Firma Invitrogen, die Visualisierung der Strukturen durch Immunfluoreszenzfärbung mit anschließender Fluoreszenzmikroskopie und natürlich die Analyse am ADVIA 2120®. Hier wurde stets das NACU Gate der neuen Software (Version 6.10.) betrachtet und ausgewertet. Diese Methoden wurden mit verschiedenen Probenmaterialien durchgeführt. Es wurden isolierte Neutrophile Granulozyten sowie zellfreie Überstände, Plasma und schließlich Vollblut sowie daraus gewonnene Blutausstriche, untersucht. Die Nachweismethoden und Materialien wurden dann kombiniert und die Ergebnisse ausgewertet.
Nachdem die Etablierung der Vergleichsmethoden abgeschlossen war, wurden drei der Methoden mit in die klinische Studie übernommen. Diese waren die Quantifizierung der DNA im Plasma mithilfe des PicoGreen®-Farbstoffes, die Visualisierung und gleichzeitige Quantifizierung an immunfluoreszenzgefärbten Blutausstrichen und natürlich die Analyse am ADVIA 2120® aus Vollblut. Diese Untersuchungen wurden dann an ausgewählten Patienten durchgeführt. Einschlusskriterium für die Tiere dieser Studie war das Vorliegen einer starken systemischen Entzündungsreaktion (SIRS) mit den hierfür typischen Merkmalen. Um sowohl eine Positiv- als auch eine Negativkontrolle mitzuführen, wurde wiederum Blut von gesunden Tieren verwendet und nativ sowie stimuliert gemessen.
Ergebnisse und Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse der Voruntersuchungen ließen verschiedene Schlussfolgerungen zu. Da sich zwischen den beiden Antikoagulantien keine nennenswerten Unterschiede feststellen ließen, wurde im Zuge der klinischen Studie das EDTA verwendet. Es stellt das routinemäßig genutzte Antikoagulanz für die Proben des ADVIA 2120® dar und auch im Zuge der DNA Quantifizierung wird EDTA-Plasma als das geeignetere Probenmaterial beschrieben. Des Weiteren schied das Zymosan im Laufe der Voruntersuchungen als Stimulanz aus, da es Interferenzen mit den Messmethoden aufzeigte. In Bezug auf die Probenart, die für die einzelnen Untersuchungen genutzt werden sollten, wurde für die Quantifizierung der freien DNA das EDTA-Plasma als geeignete Probe festgelegt. Die Isolierung von Zellen und anschließende Nutzung des Überstandes erwies sich als zu zeit- und probenaufwendig, um es im Zuge einer klinischen Studie nutzen zu können. Die Verwendung von Vollblut eignet sich aufgrund der Messmethode nicht und somit blieb hier nur das Plasma, das sich als adäquates Probenmaterial darstellte. Für den ADVIA 2120® sollte das Vollblut verwendet werden. Es ist das standardmäßig verwendetet Probenmaterial und unterliegt zudem nicht dem Einfluss der Zentrifugation. Die Visualisierung zeigte die aussagekräftigsten Ergebnisse bei der Untersuchung von Blutausstrichen. Diese konnten sowohl von Patienten als auch von stimulierten Proben sehr einfach hergestellt werden und ließen sich gut auf das Vorhandensein einer NETose-Aktivität untersuchen. Die schnelle Durchführbarkeit eines Blutausstriches und das geringe Handling der Proben machten den ausschlaggebenden Unterschied zu den anderen getesteten Materialien. Die Ergebnisse blieben somit weitestgehend frei von äußeren Einflüssen. In den Untersuchungen dieser Ausstriche stellte sich heraus, dass sich in den Präparaten lediglich NETose-aktive Zellen darstellen lassen, die NETs selbst jedoch nicht zweifelsfrei angesprochen werden können. Die aktiven Zellen stellten sich aber sehr gut durch eine Kombination aus folgenden Merkmalen dar:
-Dissoziation der Kernmembranblätter
-Delobulierung des Zellkerns
-Verstärktes Signal für Histone
-Positives Signal für citrulliniertes Histon H4
Ausschlaggebendes Merkmal hierbei war das positive Signal für citrulliniertes Histon.
Im Zuge der klinischen Studie ergaben sich, jeweils im Vergleich mit den gesunden Tieren bzw. nativen Proben, signifikante Erhöhungen des NACU Count in der Patientengruppe sowie der stimulierten Proben. Die NETose-Aktivität war in den stimulierten Proben ebenfalls gesteigert, ohne jedoch signifikant zu sein. Die Patientengruppe zeigte hier allerdings eine verringerte Aktivität. Den Gehalt der freien DNA betrachtend, wies dieser keine Änderung für die stimulierten Proben auf – in der Patientengruppe allerdings einen sehr signifikanten Anstieg. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich NETs sehr wahrscheinlich mithilfe des NACU Counts messen lassen und auch in einem Anstieg freier DNA wiederspiegeln. Jedoch lässt sich durch die mangelnde Korrelation veranschaulichen, dass diese Methoden eine geringe Spezifität aufweisen. Somit kann eine Erhöhung des NACU Count, respektive des DNA-Gehaltes, sowohl für eine gesteigerte NETose Aktivität also auch für anderweitige Freisetzung DNA-haltiger Strukturen sprechen. Dies lässt sich bislang nicht weiter eingrenzen und bedarf weiterer Untersuchungen.