Development and molecular studies on Equine Herpesvirus type 1 (EHV-1) vaccine against foot and mouth disease virus

Equine herpesvirus-1 is an alphaherpesvirus affecting equid species resulting in severe clinical outcomes manifested clinically as respiratory infection, abortion and nervous manifestations. EHV-1 establishes cell-associated viremia, following respiratory infection, reaching the target endothelial lining of blood vessel of reproductive tract and nervous system, resulting in vasculitis and thrombosis exhibited as clinical outcomes. Although PBMC-EC interface is very crucial in virus pathogenesis and clinical outcomes advent, the mechanisms underlying virus transfer from infected PBMC to EC are still unknown. To investigate these mechanisms, two-step en passant mutagenesis, functional assays (contact assays, transwell assays and flow chamber assay) together with confocal immunofluorescence data and laser scanning live cell imaging and electron microscope were executed. The single viral particle or viral cluster was found to colocalize with the extracellular matrix components. Viral particle or viral clusters embedding within these extracellular matrices are protected from the neutralizing antibodies and efficiently transmitted to endothelial cells. Destruction of this extracellular matrix from infected PBMC surface affects the infectious capability of PBMC. EHV-4, although found colocalized with ECM, is not transmitted from infected PBMC either in the static or dynamic conditions conjecturing their trapping and inactivation in these structures. Two genes, gB and gD have been implicated their role in virus transfer between PBMC and EC. Another two important mechanisms were assessed for the first time, membrane fusion between infected PBMC and endothelial cell as a mode of cell-to-cell transmission and the other one is the transcellular migration of PBMC into the endothelial cells transferring the virus to them. Two important events had been detected and caught by electron microscopy and require further and deep investigation. The first event is the first-time detection of microvesicle including equine herpesvirus-1 viral particle augmenting their role in viral life cycle and virus spread. EHV-1 was also found in a tight junction between infected and uninfected endothelial cells raising their role in viral cell-to-cell between endothelial cells.
UL56 is a phosphorylated type II membrane early protein which has a function in downregulating MHC class I and other surface molecules. To assess their role in virus transfer between PBMC and endothelial cells in EHV-1 and EHV-4, different set of mutants were generated by two-step en passant mutagenesis. The deletion mutants and swapping mutants of UL56 in EHV-1/4 showed no significant difference in the in vitro growth properties compared to their parental viruses. The deletion mutants and swapping mutants of UL56 between the two viruses had no role in virus transfer in both static or dynamic conditions. The expression levels of adhesion molecules of the surface of mutant-infected PBMC very late antigen (VLA-4) and leucocyte function-associated antigen (LFA-1) showed no statistical significant difference compared to their parental viruses (EHV-1 or EHV-4 WT). The results manifested that UL56 alone or /swapping in or between EHV-1 and EHV-4 has no effect in virus transfer between PBMC and endothelial cells raising the questions of the other cellular and viral partner that could help UL56 to affect virus transfer as happens with MHC-1 downregulation.
As FMD is one of the most contagious and highly economically viral disease affecting cloven-hoofed animals, it causes severe economic losses and social consequences. The most available used inactivated vaccines for FMD are short-lived humoral immunity, need cold chain containment, can`t protect against different serotypes and even sub serotypes and have difficulties in production. Construction of rH-P1 of FMD was performed and confirmed by PCR, RFLP, and sequencing for future using against FMD to differentiate between vaccinated and humoral immunity following natural infection (DIVA capability), not need for cold chain containment and finally, production of cellular and humoral immunity. Recombinant growth properties (plaque size and growth kinetics) were compared to their parental virus pRacH, P1 integration and expression were assessed by immunofluorescence and western blotting. The virus had been prepared and sent for future animal experiment challenge. Entwicklung und molekulare Charakterisierung eines Equinen Herpesvirus Typ 1-basierten Impfstoffes gegen das Maul-und-Klauenseuche-Virus

Das Equine Herpesvirus Typ 1 (EHV-1) ist ein Alphaherpesvirus, welches Equiden befällt und schwere klinische Symptome wie Infektionen des Respirationstraktes, Aborte und Nervenleiden hervorrufen kann. EHV-1 etabliert nach Infektion über die Atemwege eine zellassoziierte Virämie und erreicht so die Endothelien der Gefäße im Reproduktionstrakt und im Nervensystem. Dies führt zu Vaskulitiden und Thrombosen, welche sich im klinischen Bild widerspiegeln. Obwohl die Schnittstelle zwischen den mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) und den Endothelzellen (EZ) immens wichtig für Pathogenese und Klinik der Erkrankung ist, sind die zugrundeliegenden Mechanismen zum Transfer des Virus von PBMCs zu EZs nicht bekannt. Um diese zu untersuchen, wurden neben Two-step en passant Mutagenese und funktionalen Assays (Kontaktassays, Transwell Assays und Durchflusskammer Assays) auch konfokale Immunofluoreszenzmikroskopie, Laser-Scanning Live Cell Mikroskopie und Elektronenmikroskopie durchgeführt. Einzelne Viruspartikel oder Viruscluster kolokalisierten mit Komponenten der extrazellulären Matrix. Viruspartikel oder Viruscluster, die in dieser extrazellulären Matrix eingebettet sind, sind dadurch vor neutralisierenden Antikörpern geschützt und können effizient an EZs übertragen werden. Abbau der extrazellulären Matrix auf der Zelloberfläche von PBMCs beeinflusst deren Infektionsfähigkeit. EHV-4 hingegen, welches auch in der extrazellulären Matrix lokalisiert ist, wird nicht durch PBMCs übertragen; weder in statischen noch in dynamischen Konditionen. Dies lässt vermuten, dass die Haftung von EHV-4 in diesen Strukturen zu einer Virusinaktivierung führt.
Zwei EHV-Gene, gB und gD, spielen eine Rolle im Transfer des Virus von PBMCs zu EZs. Zwei weitere wichtige Mechanismen wurden hier zum ersten Mal beschrieben: Membranfusionen zwischen PBMCs und EZs als ein möglicher Weg der Zell-zu-Zell-Übertragung, sowie die transzelluläre Migration der PBMCs in die EZs. Zwei wichtige Ereignisse wurden via Elektronenmikroskopie detektiert und müssen weiterverfolgt und genauer beschrieben werden. Das erste Ereignis ist der erste Nachweis von EHV-1 Viruspartikel enthaltenden Mikrovesikeln, der damit deren Bedeutung sowohl im Virus Replikationszyklus als auch in der Virusausbreitung erweitert. EHV-1 wurde außerdem in einer tight junction zwischen infizierten und uninfizierten EZs detektiert, was deren Rolle in der Zell-zu-Zell-Übertragung zwischen EZs unterstreicht.
UL56 ist ein phosphoryliertes Typ II Membranprotein mit früher Kinetik, welches eine Rolle in der Herabregulation von MHC-Klasse I und anderen Oberflächenmolekülen spielt. Um die Rolle von UL56 im Virustransfer zwischen PBMCs und EZs in EHV-1 und EHV-4 zu bestimmen wurden verschiedene Virusmutanten per two-step en passant Mutagenese generiert. Die Deletionsmutanten, sowie Austauschmutanten von UL56 in EHV-1 und EHV-4 zeigten keine signifikanten Unterschiede in in vitro Wachstumseigenschaften im Vergleich zu den parentalen Viren. Die Deletionsmutanten, sowie Austauschmutanten von UL56 in beiden Viren spielen keine Rolle bei der Virusübertragung, weder in statischen noch in dynamischen Konditionen. Expressionslevel von Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche von PBMCs welche mit den Virusmutanten infiziert wurden, das very late antigen (VLA-4) und das leucocyte function-associated antigen (LFA-1), zeigten keinerlei statistisch signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den parentalen Viren (EHV-1 und EHV-4 Wildtyp). Diese Ergebnisse festigen die Annahme, dass UL56 allein und/oder Austauschmutanten in EHV-1 und EHV-4 keinen Effekt auf den Virustransfer zwischen PBMCs und EZs hat und wirft Fragen zu anderen zellulären oder viralen Interaktionspartnern auf, die mit UL56 bei der Beeinflussung des Virustransfers durch MHC-1 Herabregulation zusammenwirken.
Maul- und Klauenseuche (Foot-and-mouth disease, FMD) ist eine der ansteckendsten Krankheiten von Paarhufern, führt zu hohen wirtschaftlichen Verlusten und hat soziale Auswirkungen. Die am meisten genutzte inaktivierte Vakzine gegen FMD ruft eine kurzzeitige humorale Immunität hervor, benötigt eine geschlossene Kühlkette, schützt nicht gegen verschiedene Serotypen und Sub-Serotypen und ist schwierig herzustellen. Die Konstruktion von FMD rH-P1 wurde per PCR, RFLP und Sequenzierung bestätigt. Diese Vakzine ist für den späteren Gebrauch gegen FMD bestimmt und differenziert zwischen geimpften Tieren und Tieren, die eine humorale Immunität durch eine natürliche Infektion erlangt haben (DIVA). Außerdem benötigt sie keine geschlossene Kühlkette und führt zu einer zellulären und humoralen Immunität. Die Wachstumseigenschaften des rekombinanten Virus (Plaque Größen und Wachstumskinetiken) wurden mit dem parentalen Virus pRacH verglichen. P1 Integration und Expression wurden per Immunfluoreszenz und Westernblot bestätigt. Das Virus wurde hergestellt und für Testungen in Tierversuchen verschickt.