Untersuchungen zur Assoziation zwischen Alloantikörpern bei Rindern und der Bovinen Neonatalen Panzytopenie

Die Bovine Neonatale Panzytopenie (BNP) ist eine seit Ende 2006 beobachtete, oft tödliche verlaufende Krankheit bei neugeborenen Kälbern in Europa. Das klinische Bild der BNP ist geprägt von einer stark erhöhten Blutungsneigung, einer extremen Thrombo¬zyto¬penie und Leuko¬zyto¬penie sowie von einer massiven und in vielen Fällen irreversiblen Knochen¬marks¬schädigung. Die Ursache der BNP war zunächst unbekannt. Zu Beginn der in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen deuteten erste experimentelle Daten darauf hin, dass BNP eine immun¬pathologische Erkrankung ist, bei der impfinduzierte maternale Allo-AK, die von empfänglichen Kälbern mit dem Kolostrum aufgenommen werden, ursächlich sind.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren deshalb, den epidemiologischen Zusam-men¬hang zwischen dem Auftreten von BNP-Fällen und von Allo-AK bei Rindern näher zu beleuchten und die nachgewiesenen Allo-AK, vor allem bezüglich ihrer Wirkung auf die Zielzellen, näher zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde auf Basis des von Bridger et al. (2011) entwickelten Tests eine Durch¬fluss¬zytometrie-Methode (DFZM-Allo-AK-Test) etabliert, mit dem Allo-AK in Serum- und Kolostrumproben von Rindern unter Verwendung verschiedener Testzellen sowohl qualitativ als auch quantitativ nachweisbar sind. Als Testzellen wurden Lymphozyten, Monozyten, Granulo¬zyten und Thrombozyten aus dem Blut gesunder Spenderkälber sowie Zellen der bovinen Linien BL-3 und MDBK verwendet. Für die serologischen Untersuchungen standen Serum- und Kolostrum¬proben (n = 166 bzw. n = 13) von weiblichen Rindern aus zwei PregSure® BVD-Impfbetrieben sowie Serumproben aus einem Bovilis® BVD-MD-Impfbetrieb (n = 50) und einem Bovidec®-Impfbetrieb (n = 50) zur Verfügung. Als Kontrollproben dienten Serum- und Kolostrumproben (n = 50 bzw. n = 3) aus zwei Betrieben, in denen nicht gegen BVDV geimpft wurde und welche im Sinne der BVDV-Verordnung als BVD-unverdächtig galten (Kontrollbetriebe). Einige Serum- (n = 27) und Kolostrumproben (n = 7) aus den PregSure® BVD-Impfbetrieben stammten von Kühen, die wenigstens einmal ein Kalb geboren hatten, das später an BNP erkrankt war (BNP-Mütter). Zur Bestimmung der Immunglobulinklasse und des IgG-Subtyps der Allo-AK wurde der DFZM-Allo-AKMDBK-Test unter Verwendung entsprechender kommerzieller Sekundärantikörper eingesetzt. Die Prüfung der Rinderseren auf ihre zytotoxische Wirkung erfolgte mit dem MTT-Test an MDBK-Zellen, ihre Apoptose- und Nekrose-induzierende Aktivität wurde DFZM-basiert mit dem Annexin V-FITC Assay Kit (Fa. AbD Serotec) analysiert. In einem DFZM-basierten Phagozytose-Test wurde geprüft, ob Allo-AK-haltige Rinderseren die Zytophagozytose von BL-3-Zellen durch bovine Makrophagen in vitro zu stimulieren vermögen.
An den 166 Serumproben aus den zwei PregSure® BVD-Impfbetrieben wurde ersichtlich, dass die in den verschiedenen DFZM-Test-Formaten erzielten Mess¬werte für Allo-AK gut miteinander korrelierten (Korrelationskoeffizient r von 0,70 bis 0,95). Da die Allo-AK-haltigen Seren BL-3-Zellen agglutinierten, wurde ein Serum-Lang¬sam-Agglutinationstest (SLA) etabliert, dessen Messwerte mit denen des DFZM-Allo-AKBL-3-Tests gut korrelierten (r = 0,89).
Im DFZM-Allo-AKLeuko- und DFZM-Allo-AKThrombo-Test wiesen die Kühe der beiden PregSure® BVD-Impfbetriebe, unabhängig von der verwendeten Testzelle, im Mittel hoch signifikant höhere Allo-AK-Titer auf, als Rinder in dem Bovilis® BVD-MD- und dem Bovidec®-Impfbetrieb sowie in den beiden Kontrollbetrieben (p ≤ 0,001). Auch mit den beiden Zelllinien BL-3-Zellen und MDBK-Zellen zeigten die Kühe aus den beiden PregSure® BVD-Impfbetrieben im Durchschnitt hoch signifikant (p ≤ 0,001) bzw. signifikant (p ≤ 0,01) höhere Allo-AK-Titer als die Kühe aus den anderen Betrieben.
Unter den mit PregSure® BVD geimpften Kühen waren bei den BNP-Müttern im Durchschnitt hoch signifikant höhere Allo-AK-Titer nachweisbar als bei den Nicht-BNP-Müttern (p ≤ 0,001). In den beiden PregSure® BVD-Impfbetrieben stieg der Anteil Allo-AK-positiver weiblicher Rinder pro Altersgruppe von den zweijährigen bis zu den fünfjährigen Rindern stetig an (von 10 % in Betrieb A bzw. 22 % in Betrieb B auf 100 % in beiden Betrieben). Auch in den Kolostrumproben von PregSure® BVD-geimpften Kühen (n = 13) waren BNP-assoziierte Allo-AK nachweisbar, wobei der Allo-AK-Titer im Kolostrum im Mittel 1,35-mal so hoch war wie der Titer in der korres¬pondie¬renden Serumprobe. Bei den Kühen aus dem Bovidec®-Impfbetrieb konnten ebenfalls Allo-AK in Serumproben nachgewiesen werden. Im Mittel waren diese Allo-AK-Titer aber je nach verwendetem Testzelltyp hoch signifikant (p ≤ 0,001) bzw. signifikant (p ≤ 0,01) niedriger als bei den mit PregSure® BVD-geimpften Rindern.
Im Gegensatz zu Allo-AK-negativen Serumproben reduzierten Allo-AK-haltige Proben die Vitalität von MDBK um durchschnittlich 67,6 % (p < 0,001). Der zytotoxische Effekt trat aber nur dann ein, wenn die Testansätze mit Meer¬schweinchen-komplement supple¬mentiert wurden. Ein direkter zytotoxischer Effekt der Allo-AK-haltigen Serumproben auf MDBK-Zellen war ebensowenig nachweisbar, wie eine direkte, Apoptose- oder Nekrose-induzierende Aktivität. Der Phagozytose-Test war methodisch aufwändig und lieferte inkonsistente Resultate. In einigen Versuchs-ansätzen wurde beobachtet, dass die Präinkubation von BL-3-Zellen mit Allo-AK-haltigen Seren deren nachfolgende Ingestion durch Makrophagen förderte. In DFZM-basier¬ten kompetitiven Bindungs¬studien konnten die Allo-AK-haltigen Serum¬proben die Bindung der MHC I-spezifischen, monoklonalen Antikörper IL-A88 und W6/32 an MDBK-Zellen nicht verhindern.
Allo-AK waren in beiden untersuchten Immun¬globulin¬klassen (IgG und IgM) sowie bei beiden geprüften IgG-Subtypen (IgG1 und IgG2) nachweisbar. Die Titer-Unterschiede zwischen Allo-AK-haltigen und Allo-AK-negativen Rinder¬serum¬proben waren für IgG1 am größten, was den Schluss zuließ, dass IgG1-Allo-AK den Gro߬teil der Allo¬reaktivität in den Serum¬proben der PregSure® BVD-geimpften Rinder ausmacht.
Insgesamt betrachtet, stützt der statistisch zu sichernde Zusammenhang zwischen der Verwendung des Impfstoffes PregSure® BVD und dem Vorhandensein von Allo-AK gegen ein breites Spektrum an bovinen Zellen (Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten, BL-3-Zellen und MDBK-Zellen) im Serum der geimpften Rinder die Hypothese, dass dieser Impfstoff für die Induktion solcher Antikörper entscheidend ist. Weiterhin bestätigt der Nachweis von Allo-AK im Kolostrum von PregSure® BVD-geimpften Kühen die Theorie, dass BNP bei empfänglichen Kälbern erst durch die Aufnahme von Allo-AK mit dem Kolostrum ausgelöst wird. Die in dieser Arbeit erhobenen experimentellen Daten lassen noch keinen Schluss zu, über welche molekularen und zellulären Mechanismen die Allo-AK die für die BNP charakteristischen Panzytopenie verursachen. Wahrscheinlich handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, in dem der Komplement-vermittelten Zytolyse sowie der Allo-AK-vermittelten Zyto¬phago¬zytose größere Bedeutung zukommt als der direkten Induktion von Apoptose oder Nekrose.