Molekularer Aufbau der glomerulären Schlitzmembran- eine ultrastrukturelle Untersuchung

Der glomeruläre Filter stellt durch seine Vielschichtigkeit und seine dreidimensionale Struktur ein komplexes Gebilde dar. Für die heutige Forschung ist die glomeruläre Schlitzmembran eine Schlüsselstruktur im Nierenfilter und deshalb von enormer Wichtigkeit. Zahlreiche Moleküle sind am Aufbau der Schlitzmembran beteiligt. Das intrazellulär verankerte Protein Podocin, sowie die zwei Transmembranproteine Nephrin und Neph1 bilden die Hauptbestandteile der Schlitzmembran, während einige andere, zum Teil noch unbekannte Proteine, am Schlitz ebenso wichtige Funktionen ausüben. Um weitere Puzzlestücke bezüglich des Aufbaus der Schlitzmembran zusammenzusetzen, wurde erstmals durch diese Arbeit versucht, eine Quantifizierung der drei Hauptbestandteile der Schlitzmembran durchzuführen. Zu Beginn des Projektes wurde durch ein Pre-embedding-Verfahren die qualitative, elektronenmikroskopische Darstellbarkeit von Nephrin am Schlitz getestet. Daraufhin wurde für Podocin, Nephrin und Neph1 eine quantitative Analyse durch die SDS-Freeze Fracture Replika-Technik am Elektronenmikroskop durchgeführt. Für jedes der drei Proteine wurden Färbungen an drei Wildtypen getestet. Für Podocin ergab dies einen Wert von 84,94 Goldmarkierungen pro µm², Nephrin war mit 5,82 Goldmarkierungen pro Schlitz vorhanden und für Neph1 konnten 3,04 Markierungen pro Schlitz vermerkt werden. Damit die genaue Lokalisation von Nephrin und Neph1 an der Schlitzmembran visualisiert werden kann, wurde eine Doppelfärbung der zwei Proteine angefertigt. Diese ergab kein geordnetes Muster der zwei Proteine. Nach erfolgter Quantifizierung der Wildtypen wurde von allen drei Proteinen eine Knockout-Maus verwendet, um eine Negativkontrolle der Färbungen zu erhalten. Podocin zeigt eine circa 80%ige Reduktion der Gold-Markierungen, während Nephrin und Neph1 nahezu frei von Markierungen waren. Um neue Kandidaten des Schlitzmembranproteinkomplexes elektronenmikroskopisch darzustellen, wurden Immunfluoreszenz-Fäbrbungen und Western Blots einiger auserwählter Proteine angefertigt, die im Rahmen einer Proteomic-Analyse von Prof. Bernd Fakler und Dr. Florian Grahammer als mögliche Schlitzmembranproteine identifiziert wurden. Ein Antikörper gegen die Tyrosinkinase MerTK zeigte eine klare Bande im Western Blot und konnte für die SDS-FRL verwendet werden. Dadurch konnte dieses Protein erstmals am Schlitz quantifiziert mit einem Mittelwert von 3,43 AK-Bindungen quantifiziert werden. Durch die Anwendung der SDS-FRL in der Nierenforschung und insbesondere an der glomerulären Schlitzmembran, konnte durch die vorliegende Arbeit diese Immunogold-Technik in der ultrastrukturellen, quantifizierenden Forschung durch ihre hohe Sensitivität und gute Umsetzbarkeit, etabliert werden.