UNTERSUCHUNGEN ZUR KRYOKONSERVIERUNG VON PSITTAZIDENSPERMA AM BEISPIEL DES NYMPHENSITTICHS (NYMPHICUS HOLLANDICUS)

Ziel dieser Studie war es, ein effektives Protokoll zur Kryokonservierung von Papageiensperma durch eine schrittweise Evaluierung zu entwickeln. Nymphensittiche (Nymphicus hollandicus) wurden als Modelltiere gewählt, da sie aufgrund ihrer geringen Größe leicht zu halten sind und in Menschenobhut nahezu ganzjährig zuverlässig reproduzieren. Des Weiteren lagen für diese Spezies bereits Orientierungsdaten zum Vergleich der Spermawerte vor und die Techniken der assistierten Reproduktion wurden zudem im Vorfeld der Studie an dieser Spezies erfolgreich angewendet.
Im Vorversuch der Studie wurden regelmäßige Spermaentnahmen an einer Gruppe von 30 männlichen Nymphensittichen durchgeführt, um die Ausgangswerte der Spermaparameter für den folgenden Hauptversuch zu erhalten. Insbesondere der pH- (x ̅ = 7,4) und der Osmolalitätswert (x ̅ = 297 mOsm/kg) von nativem Sperma waren von großer Bedeutsamkeit für den weiteren Verlauf der Studie, da im ersten Teil der Hauptstudie drei verschiedene Spermaverdünner (SV 1 = Verdünner nach LAKE UND STEWART (1978); SV 2 = Verdünner nach BLANCO U. A. (2008); SV 3 = Beltsville-Poultry-Semen-Extender nach SEXTON (1977)) spezifisch auf die Physiologie von Nymphensittichspermien angepasst und entsprechend des pH-Wertes und Osmolalitätswertes modifiziert wurden, um eine optimale Grundlage zur Langzeitkonservierung zu schaffen. Mithilfe von 64 Einzelproben wurde jeder der drei Spermaverdünner wurde in zwei unterschiedlichen Verdünnungsstufen (1:4 und 1:8) hinsichtlich Spermienmotilität, -vitalität und -morphologie über einen Zeitraum von 120 Minuten zu fünf Untersuchungszeitpunkten evaluiert. Im zweiten Teil der Studie wurden dem Sperma, das mit dem besten Verdünner versetzt wurde, drei verschiedene Kryoprotektiva (Glyzerin, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid) in drei unterschiedlichen Konzentrationen (4 %, 8 %, 12 %) zugegeben, um dasjenige mit den geringsten Negativeinflüssen auf die Spermienqualität als Gefrierschutzmittel zur weiteren Verwendung zu evaluieren. Der nächste Schritt lag in der Evaluierung des Einflusses verschiedener Kühlraten auf Spermienmotilität, -viabilität und -morphologie. Hierzu wurde dasjenige Spermaverdünner/Kryoprotektivum-Gemisch mit den besten Ergebnissen eingesetzt und die Spermaproben wurden vergleichend mit einer schnellen Kühlrate (> 50 °C/min) und einer kontrollierten, langsamen Gefrierrate mithilfe des programmierbaren Einfrierautomaten IceCube 14S eingefroren. Im letzten Versuchsteil wurden erneut Spermaproben auf die Weise eingefroren, die sich als die vielversprechendste Methode in den vorangegangenen Versuchsteilen etabliert hatte. Zwei Gruppen weiblicher Nymphensittiche wurden mit endoskopisch vasektomierten Nymphensittichhähnen vergesellschaftet, um ein natürliches Fortpflanzungsverhalten zu stimulieren und gleichzeitig eine natürliche Fertilisation zu verhindern. In einem Cross-over-Fertilisationsversuch wurden die Hennen aus Gruppe 1 zunächst artifiziell mit Frischsperma als Kontrolle inseminiert, während die Hennen aus Gruppe 2 aufgetaute Tiefgefrierspermaproben erhielten. Im zweiten Fertilisationsexperiment wurden die Gruppen getauscht, um individuelle Einflüsse der Hennen auszuschließen. Letztendlich ergab die Befruchtungsrate Aufschluss über die Effektivität des entwickelten Protokolls.
Nach 120 Minuten Beobachtungszeit bewies der modifizierte Lake-Verdünner in der Verdünnungsstufe 1:4 in den Standarduntersuchungen zur Spermienqualität die besten Ergebnisse hinsichtlich Spermienbeweglichkeit (59,1 %), -lebendrate (75,3 %) und des Anteils morphologisch unveränderter Spermien (43,38 %)und wurde folglich zur weiteren Evaluierung des Protokolls eingesetzt. Von den verwendeten Kryoprotektiva hatte Glyzerin in allen eingesetzten Konzentrationen den signifikant schlechtesten Einfluss auf die Spermienqualität (MOT < 6 %, Lebendrate < 21 %), wohingegen Dimethylacetamid in 8%iger Endkonzentration die besten Ergebnisse hinsichtlich Spermienmotilität (54,1 %) und -viabilität (73 %) aufweisen konnte und daher als Gefrierschutzmittel zur Kryokonservierung im weiteren Versuchsablauf eingesetzt wurde. Bei der Evaluation des Einflusses schneller und langsamer Kühlraten im Einfrierprozess war klar ersichtlich, dass signifikant höhere Überlebens- und Beweglichkeitsraten bei langsamen Einfrierraten unter Zuhilfenahme eines programmierbaren Einfrierautomaten erzielt werden konnten. Schnelle Einfrierraten, inklusive Vitrifikation, führten in allen Fällen zu einem Absinken von Viabilität und Motilität auf Werte nahe 0 %. Der abschließende Fertilistationsversuch demonstrierte, dass die nach Auftauen mittlere Überlebensrate von 29,8 ± 14,2 % (x ̅ ± SD) bei einer Gesamtbeweglichkeit von 22,2 ± 11,3 % (x ̅ ± SD) und Vorwärtsbeweglichkeit von 10,7 ± 7,9 % (x ̅ ± SD) zur erfolgreichen artifiziellen Insemination von weiblichen Nymphensittichen ausreichte. Bei der Verwendung von Tiefgefriersperma konnten Befruchtungsraten von 30,8 % und 18 % erreicht werden. Im Vergleich dazu wurden in der Kontrollgruppe unter Verwendung von Frischsperma Befruchtungsraten von 92,6 % und 67,7 % erzielt.
Mit dieser Studie wurde erstmalig ein erfolgreiches Protokoll zur Kryokonservierung von Nymphensittichsperma evaluiert. Insgesamt schlüpften aus 17 befruchteten Eiern der Besamungsversuche mit Tiefgefriersperma 12 Küken. Zudem wurden erstmalig die Einflüsse verschiedener Verdünner, Kryoprotektiva und Einfriermethoden auf die Standardparameter von Papageiensperma untersucht und beschrieben. Ob und inwieweit die Erkenntnisse des anhand von Nymphensittichen entwickelten Einfrierprotokolls auf andere Papageienspezies übertragbar und anwendbar sind, sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.