Identification of Metabolic Prognostic Markers in Liver Diseases After Carbon Tetrachloride Intoxication

Chronic liver disease is a common clinical problem. Currently, the diagnosis is based on non-invasive techniques like e.g. fibroscan, MRI, elastography, on minimal-invasive techniques like e.g. liver transaminases, and on the invasive biopsy method. However, these aforementioned methods have several drawbacks. Briefly, non-invasive methods are usually not-sensitive to early chronic liver disease; whereas blood based liver enzymes are not specific for liver. Therefore, the gold standard for the diagnosis of hepatic diseases is the histological assessment of liver biopsies. The use of liver biopsies is, however, subject to sampling- as well as inter- and intra-observer variability. These limitations affect the diagnostic accuracy, reliability, and responsiveness of treatment end-points. Moreover, liver biopsies are risky for the patient because of potential bleeding, organ perforation and even death. Thus, an urgent medical need exists for reliable and highly accurate treatment end-point indicators that can replace liver biopsies.
In this thesis the use of metabolite screening for diagnosis and staging is suggested to be used. It is well accepted that acute and chronic intoxications alter the regulation of liver metabolism at different levels. The blood or urine metabolome should therefore represent the final outcome of liver cellular regulation and the phenotype of a disease. The scope of this thesis is to establish and to validate marker(s) based on metabolite levels, both for the early diagnosis of liver diseases and for the prediction of liver disease progression. To achieve this goal, a metabolite screening for diagnosis and staging was performed to identify the presence and severity of inflammation and fibrosis in murine livers and blood. To characterize the metabolic alterations upon acute and chronic liver intoxications, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was employed. NMR is fully quantitative, highly reproducible, detects all metabolites simultaneously in one non selective measurment, it is non-invasive, non-destructive and allows for a complete recovery of the sample. Moreover, just a minimum of sample preparation with no need for derivatization is required.
In order to induce acute toxic liver injuries, male C57BL/6N mice exposed to a single dose of CCl4 were used. Moreover, chronic liver damage was induced by repeated injections of CCl4 for 6 weeks. At specific time points both blood and livers of the mice were harvested. A control group received the same dose of just olive oil. Three to four mice were used for each group. Further, MDR2-/- mice (6 months old) were treated with Ly2157299 (Galunisertib; ALK5 inhibitor). ALK5 (TGFβ type I receptor kinase) was used to interfere with TGFβ signalling in MDR2-/- mice. Two groups of mice were used. Ly2157299 treated mice for 14 consecutive days (150 mg/kg) orally. The vehicle treated group received the same amount for 14 days orally. Two days after the last injection, both blood and livers were harvested.
Biochemical parameters e.g. ALT and AST increased during disease progression upon CCl4 injection. This alteration was correlated with accumulation of extracellular matrix (ECM) and ECM-producing cells as indicated by picro-sirius red and alpha-SMA staining, respectively. These data give us a deep insight into the test models, where both acute and chronic liver damage were confirmed.
Blood plasma-based metabolic profiling was performed. Surprisingly, some metabolites e.g. acetate, alanine, formate, glucose, glutamine, lactate and phenylalanine are considered very good predictors for chronic liver diseases - regardless to spatial (septal or biliary fibrosis) extracellular matrix- as indicated by AUC approximately 1.000. However, in the septal CCl4-induced fibrosis model betaine, citrate, glutamine and phenylalanine, however, in biliary fibrosis 3-Hydroxyisobutyrate, formate, glutamate, glycine, methionine and tyrosine can be used to stage the disease. These differences in metabolite levels can be explained by hepatic zonation of extracellular matrix deposition. It is generally accepted that in CCl4 induced injury, glutamine synthesis, glycolysis, tricarboxylic acid cycle and phase I as well as phase II drug metabolism are principally altered. Whereas urea formation, gluconeogenesis and oxidative phosphorylation are mainly affected in case of biliary fibrosis, further validation in clinical cohorts is absolutely mandatory and will be a followup story.
My study shed light on the importance of the metabolites identified in septal and biliary fibrosis: i) Validation in clinical cohorts of circulatory based liver disorders (septal fibrosis) and cholestasis (biliary fibrosis); this provides the scientists working in the field of liver diseases with a list of biomarkers; ii) Molecular analysis of chronic liver disease progression and comparing this blood based metabolic profiling with liver tissue to mechanistically understand disease dynamics; and iii) Providing metabolism scientists with quantitative data for single metabolites in a time-dependent manner for further functional analysis. Identifizierung von metabolischen Prognosemarkern bei Lebererkrankungen nach Tetrachlorkohlenstoff intoxikation

Chronische Lebererkrankungen sind ein häufiges klinisches Problem. Gegenwärtig basiert die Diagnose auf nicht-invasiven Verfahren wie z.B. Fibroscan, MRT und Elastographie, sowie auf minimal-invasiven Verfahren wie z.B. Bestimmungen der Lebertransaminasen und schließlich auf der invasiven Biopsie-Methode. Die genannten Verfahren haben jedoch einige Nachteile. So sind nicht-invasive Verfahren in der Regel nicht zur Früherkennung von chronischen Lebererkrankungen geeignet, während die Leberenzyme im Blut keine für die Leber spezifischen Aussagen erlauben. Der Gold-Standard für die Diagnose von Lebererkrankungen ist daher die histologische Beurteilung von Leberbiopsien. Die Verwendung von Leberbiopsien unterliegt jedoch Unsicherheiten sowohl bei der Probennahme als auch durch Inter- und Intrabeobachter-Variabilität. Diese Einschränkungen beeinflussen die diagnostische Genauigkeit, die Zuverlässigkeit und das Ansprechen der Methode auf den Behandlungserfolg. Darüber hinaus sind Leberbiopsien für den Patienten wegen möglicher Blutungen, Organperforation und einer nicht zu vernachlässigenden Letalitätsquote riskant. Daher besteht ein dringender medizinischer Bedarf an zuverlässigen und hochgenauen Behandlungsendpunkt-Indikatoren, die Leberbiopsien ersetzen können.
In dieser Arbeit wird die Verwendung eines Metabolit-Screenings für die Diagnose und die Beurteilung des Verlaufs von Lebererkrankungen vorgeschlagen. Es ist allgemein anerkannt, dass akute und chronische Leberschädigungen die Regulation des Lebermetabolismus auf verschiedenen Ebenen verändern. Das Blut- oder Urin-Metabolom sollte daher das endgültige Ergebnis der Leberzellregulation und des Phänotyps einer Krankheit wiedergeben. Der Gegenstand dieser Arbeit ist die Etablierung und Validierung von Markern basierend auf Metabolitenkonzentrationen, sowohl für die Früherkennung von Lebererkrankungen als auch für die Vorhersage des Verlaufs der Lebererkrankung. Dazu wurde ein Metabolit-Screening für die Diagnose und die Untersuchung des Krankheitsverlaufs durchgeführt, um das Vorhandensein und die Schwere von der Entzündung und der Fibrose in den Lebern und im Blut von Mäusen nachzuweisen. Zur Charakterisierung der metabolischen Veränderungen bei akuten und chronischen Leberschädigungen wurde die kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMRSpektroskopie) eingesetzt. Die NMR ist vollständig quantitativ, gut reproduzierbar, detektiert alle Metaboliten gleichzeitig in einer nichtselektiven Messung, ist nicht-invasiv, zerstörungsfrei und ermöglicht eine vollständige Rückgewinnung der Probe. Darüber hinaus ist nur ein Minimum an Probenvorbereitung ohne die Notwendigkeit einer Derivatisierung der Probe erforderlich. Um akute toxische Leberschädigungen zu induzieren, wurden männliche C57BL / 6N-Mäuse, die eine einzige CCl4-Injektion erhalten haben, verwendet. Darüber hinaus wurde eine chronische Leberschädigung durch wiederholte Injektionen von CCl4 über 6 Wochen induziert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden sowohl das Blut als auch die Lebern der Mäuse entnommen. Eine Kontrollgruppe erhielt die gleiche Dosis an reinem Olivenöl. Drei bis vier Mäuse wurden für jede Gruppe verwendet. Weiterhin wurden MDR2 -/- Mäuse (4 Monate alt) mit Ly2157299 (Galunisertib; ALK5-Inhibitor) behandelt. ALK5 (TGFβ Typ I Rezeptorkinase) wurde verwendet, um das TGFβ-Signalling in MDR2 -/- Mäusen zu stören. Zwei Gruppen von Mäusen wurden verwendet: Ly2157299 wurde an die behandelten Mäuse für 14 aufeinanderfolgende Tage (150 mg / kg) oral verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt die gleiche Menge an Olivenöl für 14 Tage oral. Zwei Tage nach der letzten Injektion wurden sowohl Blut als auch Lebern entnommen.
Biochemische Parameter, z.B. ALT und AST, nahmen während des Verlaufs der Erkrankung nach einer CCl4-Injektion zu. Diese Veränderungen waren mit der Anhäufung von extrazellulärer Matrix (ECM) und ECM-produzierenden Zellen korrelierbar, wie durch Picro-Sirius-Rot- bzw. Alpha-SMA-Färbung gezeigt werden konnte. Diese Daten geben uns einen tiefen Einblick in die Testmodelle, bei denen sowohl akute als auch chronische Leberschäden bestätigt werden konnten. Auch für das Blutplasma der Mäuse wurde ein metabolisches Profil erstellt. Überraschenderweise deuten AUC-Werte von nahe 1.000 für einige Metabolite, z.B. für Acetat, Alanin, Formiat, Glukose, Glutamin, Laktat und Phenylalanin an, dass sie als sehr gute Indikatoren für chronische Lebererkrankungen betrachtet werden können, unabhängig von der räumlichen extrazellulären Matrix (Septum- oder Gallenfibrose). Im Modell der CCl4-induzierten Septumfibrose können Betain, Citrat, Glutamin und Phenylalanin für das die Untersuchung des Krankheitsverkaufs verwendet werden, während dazu bei der Gallenfibrose 3-Hydroxyisobutyrat, Formiat, Glutamat, Glycin, Methionin und Tyrosin verwendet werden müssen. Diese Unterschiede in den Metabolitenkonzentrationen können durch hepatische Zonierung der extrazellulären Matrixdeposition erklärt werden. Es ist allgemein akzeptiert, dass bei einer CCl4-induzierten Leberschädigung die Glutaminsynthese, die Glykolyse, der Tricarbonsäurezyklus sowie der Arzneimittelmetabolismus der Phase I und der Phase II prinzipiell gestört sind. Bei der Gallenfibrose sind jedoch hauptsächlich Harnstoffbildung, Glukoneogenese und oxidative Phosphorylierung betroffen. Eine weitere Validierung in klinischen Kohorten ist zwingend erforderlich und wird als Follow-Up-Studie durchgeführt.
Unsere Studie beleuchtet die Bedeutung der identifizierten Metaboliten bei Septum- und Gallenfibrose: i) Validierung der Kreislauf-basierten Leberfunktionsstörungen (Septumfibrose) und der Cholestase (Gallenfibrose) in klinischen Kohorten; die Ergebnisse liefern Wissenschaftlern, die an der Untersuchung von Lebererkrankungen arbeiten, eine Liste von Biomarkern; ii) Molekulare Analyse des Verlaufs der chronischen Lebererkrankung und Vergleich der metabolischen Profile von Blutplasma und Lebergewebe, um die Krankheitsdynamik mechanistisch zu verstehen; und iii) Bereitstellung von quantitativen, zeitabhängigen Daten für einzelne Metabolite für die weitere funktionelle Analyse durch Systembiologen.