Identifizierung und Charakterisierung von P-Glykoproteinen in kleinen Strongyliden

Identification and characterisation of p-glycoproteins in small strongyles

Cyathostomins or small strongyles are considered to belong to the most important infectious agents of horses due to their high prevalence, widely distributed anthelmintic resistance and the pathogenicy of their third and fourth stage larvae. Resistance has been first recorded for benzimidazoles (BZ). Due to widespread resistance BZ are nowadays only used with limitations to treat cyathostomin infections. Currently macrocylic lactones (ML) are used most frequently for the treatment of worm infections in horses. In spite of their intensive use the efficacy of ML is apparently almost unaltered in Europe. However, first cases of resistance have been reported in South America. Expression of p-glycoproteins (Pgps), which are able to export various xenobiotics out of cells, has been shown to be associated with increased tolerance towards anthelmintics in nematodes such as Haemonchus contortus and Teladorsagia circumcincta.
The study presented herein describes the identification and functional analysis of Pgps in small strongyles. Using RT-PCR, full-length cDNA sequences of Pgp-3 were identified in Cylicocyclus elongatus, Cylicocyclus insigne and Cylicostephanus goldi. Additionally, amplification and sequencing of a full length cDNA sequence of Pgp-9 has been accomplished for C. elongatus. All deduced proteins show the characteristics of the ABC transporter super family with two transmembrane and nucleotide-binding domains. Their molecular mass was aprox. 140 kDa.
For the first time, nematode Pgps, i.e. CegPgp-3 and CegPgp-9, were expressed in two Saccaromyces cerevisae strains (AD1-7, JRY8012) for functional characterization and identification of Pgp substrates. In both strains different numbers of endogenous ABCtransporters are deleted. The transcription of both Pgps was confirmed by RT-PCR. The detection of Pgp expression by Western Blot failed. Alternatively fluorescence activated cell scanning (FACS) was performed to demonstrate Pgp-expression. The percentage of positive cells was highest for AD1-7 CegPgp-9 and reached max. 20%. For CegPgp-3 only 2.3 – 2.7% positive cells could be detected. JRY8012 showed no expression of CegPgp-3. CegPgp-9 was only expressed in 0.58 – 1.99% of the analyzed cells.
Using an automated yeast growth inhibition assay in a 96 well plate, susceptibility of transformed yeast cells to the BZ thiabendazole and the Pgp-inhibitor and –substrate ketoconazol (KCON) was investigated. The assay consists of repeated measurements of OD600 of yeast cultures every 10 min over 48 h. All resulting growth curves were statistically analyzed. A four parametric logistic regression was used to compare relative growth of yeast strains with and without Pgp-expression and to calculate EC50 values.
No significant differences were detected for any of the JRY8012 transformants compared to the control strain with LacZ-expression, possibly due to low Pgp-expression in this yeast strain.
EC50-values of AD1-7 expressing CegPgp-9 or LacZ differed significantly. Yeasts with expression of CegPgp-9 tolerated a KCON concentration of 0.72 μM without any growth reduction in contrast to the control strain, which showed normal growth in presence of max. 0.18 μM KCON. Furthermore putative interaction of different ML with the heterogously expressed Pgp was analyzed. The results showed a concentration dependent, growth-reducing effect of EPM and IVM on AD1-7 CegPgp-9. MOX did not induce any growth change. For the control strain none of the tested ML concentrations was able to affect growth rates.
The combination of KCON (0.18 or 0.73 μM) and ML resulted in a significantly increased and concentration dependent susceptibility to KCON for all tested strains. Putative synergies between KCON and ML could not be analyzed via the applied method. Among other mechanisms a competitive replacement of KCON at one substrate binding site or a ML-induced inhibition of Pgp-activity were conceivable explications.
The established, automated, competitive growth assay constitutes a simple and cost-efficient method for functional analysis of heterologous Pgps on protein level. Identification of Pgp substrates and drug-interactions could be of advantage to achieve sustained drug efficacies and the development of new drugs, that are e.g. unaffected by Pgp expression. Auf Grund hoher Prävalenz, weit verbreiteter Anthelminthikaresistenz (AR) und ausgeprägter Pathogenität der dritten und vierten Larvenstadien gehören Cyathostomine bzw. kleinen Strongyliden zu den bedeutendsten Infektionserregern des Pferdes. Resistenzen traten als erstes gegenüber den Benzimidazolen (BZ) auf, die bereits seit mehr als 20 Jahren nicht mehr uneingeschränkt für die Therapie empfohlen werden. Makrozyklische Laktone (ML) werden heute am häufigsten für die Behandlung von mit Cyathostominen infizierten Pferden angewendet. Während die Wirksamkeit der ML gegenüber kleinen Strongyliden trotz ihres intensiven Einsatzes in Europa kaum eingeschränkt ist, fanden Untersuchungen erste MLresistente Populationen in Südamerika (Brasilien). Die Expression von P-Glykoproteinen (Pgp) mit ihrer Fähigkeit Xenobiotika aus dem Zellinneren zu exportieren, wurde in Nematoden wie Haemoncus contortus und Teladorsagia circumcincta mit einer erhöhten Toleranz gegenüber ML in Verbindung gebracht.
Die hier vorgestellte Studie untersuchte das Vorkommen und die funktionelle Bedeutung von Pgps in kleinen Strongyliden. Dabei konnten vollständige cDNA-Sequenzen des Pgp-Isotyps 3 in den Spezies Cylicocyclus elongatus, Cylicocyclus insigne und Cylicostephanus goldi mittels RT-PCR identifiziert werden. Für C. elongatus war zusätzlich die vollständige Amplifizierung und Sequenzierung von Pgp-9 möglich. Während die Ähnlichkeit der Pgp-3 cDNAs der Cyathostominen untereinander bei > 90 % lag, stimmten Pgp-3 und Pgp-9 Isotypen auf Nukleotidebene nur zu 39 % überein. Alle deduzierten Proteine zeigten die charakteristischen Merkmale der ABC-Transporterfamilie, wie z.B. je zwei Transmembran- und nukleotidbindenden Domänen. Ihre Molekülmasse lag bei ≈ 140 kDa.
Zur funktionellen Charakterisierung und Identifizierung von Pgp-Substraten wurden erstmals die Nematoden-Pgps CegPgp-3 und CegPgp-9 in zwei Saccharomyces cerevisiae-Stämmen (AD1-7 und JRY8012) heterolog exprimiert. Beide Stämme zeichnen sich durch die Deletion von sieben bzw. drei hefeeigenen ABC-Transportern aus. Die Transkription der Transgene wurde für beide Pgps über eine RT-PCR bestätigt. Der Versuch über einen Western Blot mit Verwendung eines spezifischen anti-Pgp- (C219) und eines anti-V5-Antikörpers die Proteinexpression zu überprüfen, blieb erfolglos. Der Translationsnachweis erfolgte daher über ein fluorescence activated cell scanning (FACS). Der Anteil positiver Zellen war bei AD1-7 CegPgp-9 mit 20 % am höchsten, wobei hier anzumerken ist, daß der Antikörper nur aktives Pgp detektiert und die Versuche in Abwesenheit eines exogenen Pgp Substrats durchgeführt wurden. Bei CegPgp-3 erreichte er nur Werte von 2,3 bis 2,7 %. JRY8012 zeigte keine Expression von aktivem CegPgp-3. Für CegPgp-9 lagen die Werte nur bei 0,58 - 1,99 %.
Im 96-Well-Format wurde im Rahmen eines neu etablierten, automatisierten, kompetitiven Wachstumsassays die Suszeptibilität der transformierten Hefen gegenüber dem BZ Thiabendazol und dem Pgp-Inhibitor und –Substrat Ketokonazol (KCON) untersucht. Dabei wurde über 48 h alle 10 min die OD600 der Hefekulturen bestimmt und die ermittelten Wachstumskurven statistisch ausgewertet. Über eine logistische Regression mit vier Parametern wurde das relative Wachstums der Hefestämme mit und ohne Pgp-Expression verglichen sowie EC50 Werte berechnet. Für keinen der transformierten JRY8012-Stämme zeigten sich signifikante Unterschiede zum Kontrollstamm mit LacZ-Expression, was wahrscheinlich mit einer zu geringen Pgp-Expression zusammenhängt. Die EC50 Werte von AD1-7 CegPgp-9 und LacZ wichen hingegen signifikant voneinander ab. Hefen, die CegPgp-rd4e 9 exprimierten, tolerierten ohne Wachstumseinbußen eine KCON -Konzentration von 0,73 μM im Gegensatz zu 0,18 μM im Kontrollstamm (LacZ).
Des Weiteren wurden im gleichen Wachstumsassay verschiedene ML auf ihre potentielle Interaktion mit KCON am heterolog exprimierten Pgp untersucht. Die Ergebnisse zeigen einen moderaten, konzentrationsabhängigen und wachstumsmindernden Effekt von EPM und IVM auf AD1-7 CegPgp-9. Die Zugabe von MOX bewirkte keine Wachstumshemmung. In den verwendeten ML-Konzentrationen, die geringer waren als für die Pgp-exprimierenden Stämme, zeigte sich kein direkter Einfluss auf das Wachstum des Kontrollstammes.
Die Kombination aus KCON (0,18 bzw. 0,73 μM) mit ML führte in allen Fällen zur signifikanten, konzentrationsabhängigen Steigerung der KCON-Wirkung. Die Ursache der potentiellen Synergie zwischen KCON und ML ließ sich mit der angewendeten Methode nicht feststellen. Möglich wären unter anderem eine kompetitive Verdrängung von KCON an einer Substratbindungsstelle am Pgp oder eine ML-induzierte Inhibition der Pgp-Aktivität.
Das etablierte, automatisierte Wachstumsassay ermöglicht die einfache und kostengünstige funktionelle Untersuchung von Pgps auf Proteinebene. Die Identifizierung von Pgp-Substraten und Wirkstoffinteraktionen können von großem Nutzen sein für die nachhaltige Verwendung von Anthelminthika und die Entwicklung neuer Wirkstoffe, welche z.B. unbeeinflusst sind von der Pgp-Expression.