Morphological and Immunohistochemical investigations of normal and osteoporotic bone - an animal model of the rat

Die vorliegenden Untersuchungen wurden im Rahmen des Sonderforschungs- bereiches / Transregio 79 „Werkstoffe für die Geweberegeneration systemisch erkrankten Knochen“ durchgeführt. Sie entstanden in enger Kooperation mit den Teilprojekten T1 „Etablierung und Qualitätssicherung osteoporotischer Tiermodelle“ und B4 „Einfluss neuartiger Knochenersatzstoffe und oberflächenmodifizierter Titanlegierungen auf die Differenzierung von Osteoblasten/MSC“. Die Ergebnisse wurden innerhalb des Teilprojekts B5 „Zell-Zell- und Zell-Matrix Kommunikation: Beeinflussung von gap junctions und fokalen Adhäsionen durch Biomaterialien“ erarbeitet. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Frage zu beantworten, in welchem Ausmaß die durch Connexin 43 vermittelte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikation in Osteozyten, Osteoblasten und Osteoklasten des Rattenknochens nach differentieller Osteoporose-Induktion verändert ist. Dazu wurden die Lendenwirbel (L4) von osteoporotischen Ratten, deren Knochenstatus zuvor durch Ovariektomie und eine defiziente Diet (OVX+Diet) sowie durch Ovariektomie und Steroidverabreichung (OVX+Steroid) induziert wurde (Teilprojekt T1) mittels Connexin 43 Immunhistochemie untersucht. Sham operierte Ratten dienten als Kontrolle. Entsprechend der Induktionsmethode erfolgte die Einteilung der Ratten in drei Gruppen: Sham, OVX+Diät, OVX+Steroid. Nach 3 und 12 Monaten wurden die Tiere euthanasiert, jeweils der L4 entnommen, und in das Projekt B5 überführt. Die Proben wurden entkalkt, in Paraffin eingebettet und anschließend mittels Anti-Connexin 43 Antikörpern immunhistochemisch untersucht. Zusätzlich wurden alle Proben enzymhistochemisch gefärbt, um die Alkalische Phosphatase (ALP) Aktivität der Osteoblasten sowie die Aktivität der Tartat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) der Osteoklasten in Korrelation zu den Connexin 43 Mustern der Zellen zu beurteilen. Darüber hinaus wurden im Rahmen von in vitro Experimenten die Connexin 43 Muster von Knochenmark-abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen (MSCs) festgestellt, und die Fragestellung beleuchtet, ob die Blockierung von Connexin 43 basierten Kanälen mittels 18 β Glycyrrhizinsäure – die Stammzellen hinsichtlich ihrer Morphologie und dem Connexin 43 Muster beeinflusst. Dafür wurden MSCs, die zuvor im Rahmen des Teilprojektes B4 isoliert und in flüssigem Stickstoffe für weiterführende Untersuchungen gelagert wurden, für 24 und 48 Stunden entweder in Standardmedium oder in Medien supplementiert mit jeweils 5, 50, 75 und 100 μM 18 β Glycyrrhizinsäure kultiviert. Die Morphologie und das Aktin-Zytoskelett der Zellen wurden durch Phalloid-Immunfluoreszenz erfasst, während die Viabilität der Zellen durch den MTT Test ermittelt wurde. Die Connexin 43 Muster der Zellen wurde durch Immunfluoreszenz visualisiert. Alle Daten wurden quantitativ ermittelt und statistisch berechnet. Die Ergebnisse der Untersuchungen der Lendenwirbel (L4) zeigen eine signifikante Reduktion (p<0.05) der osteoblastären ALP-Aktivität in der OVX+Diät Gruppe nach einer drei- und zwölfmonatigen Standzeit im Vergleich zur Sham-Gruppe. Die TRAP-Färbung verdeutlicht eine hoch signifikante Zunahme der Osteoklastenanzahl in den OVX+Diät (p<0.0001) OVX+Steroid Gruppen (p<0.0001) im Unterschied zu der Sham Kontrollgruppe. Mit Blick auf die Connexin 43 Synthese der Zellen demonstrieren die Daten eine signifikante Abnahme Connexin 43 positiver Osteoblasten in der OVX+Diät Gruppe (p<0.05) und eine hoch signifikante Abnahme in der OVX+Steroid Gruppe (p<0.01) im Unterschied zu der Sham Kontrollgruppe. Darüber hinaus, war eine Abnahme der Durchschnittszahl Connexin 43 positiver Osteozyten nach einer drei- und zwölfmonatigen Standzeit in den OVX+Diät und OVX+Steroid (p<0.0001) Gruppen im Vergleich zu den altersentsprechenden Tieren Sham-Gruppe festzustellen. Ferner, war die Anzahl Connexin 43 positiver Osteoklasten signifikant erhöht in den OVX+Diät (p<0.0001) und OVX+Steroid (p<0.01) Gruppen im Vergleich zu den altersentsprechenden Tieren Sham-Gruppe. Die in vitro Untersuchungen der MSCs verdeutlichen nach einer Inkubationsdauer von 48 Stunden, dass die Zellen der Sham Gruppe eine spindelförmige Gestalt aufweisen, während die Zellen der osteoporotischen Tiere eher eine flache Gestalt besitzen und vergleichsweise größer sind. Die Connexin 43 Signale der MSCs aller Gruppe waren entlang der Membranen, innerhalb des Zytoplasmas und um die Zellkerne herum ausgeprägt, wogegen die Behandlung mittels 18 β Glycyrrhizinsäure prinzipiell eine perinukleäre Verteilung der Connexin 43 Signalmuster hervorrief. Im Zuge der Behandlung mit 18 β Glycyrrhizinsäure zeigten insbesondere die Zellen der OVX+Diät sowie die OVX+Steroid Gruppen eine Dosis-abhängige Reduktion der Zellzahl. Zusammenfassend haben die vorliegenden Ergebnisse gezeigt, dass die Connexin 43 Synthese der Knochenzellen nach der Osteoporoseinduktion deutlich verändert ist. Aufgrund der wichtigen funktionellen Rolle von Connexin 43 für die Aufrechterhaltung der Knochenzellfunktion mag das veränderte Synthesemuster für die typischerweise verringerte Knochenqualität im Rahmen der Osteoporose verantwortlich sein.