Vergleich zwischen einem kommerziellen molekularbiologischen Verfahren (real-time Polymerasekettenreaktion) und der mikrobiologischen Kultivierung zum Nachweis von Mastitiserregern

Die qPCR-Diagnostik zur Untersuchung von Milchproben auf Mastitiserreger wird seit einigen Jahren routinemäßig eingesetzt. Da es bisher kaum Vergleichsuntersuchungen zwischen der bakteriologischen Untersuchung (BU) von Viertelgemelksproben und der qPCR-Untersuchung von Sammelproben gibt, war es Ziel dieser Arbeit, die qPCR-Untersuchung von Sammelproben auf drei verschiedenen Ebenen zu evaluieren. In der ersten Studie wurde mit Hilfe der BU von Viertelgemelksproben die scheinbare Intraherdenprävalenz ermittelt und mit der qPCR-Untersuchung von Proben auf Herdenebene, also Tankmilch- und Herdenpoolproben, verglichen. In der zweiten Studie wurde eine Einschätzung der Güteparameter Sensitivität und Spezifität der qPCR in Hinblick auf die Untersuchung auf Tierebene in Form von Tierpoolproben vorgenommen. Zu diesem Zweck wurden 6.335 Viertelgemelksproben unter aseptischen Bedingungen von 1.615 klinisch eutergesunden Kühen in 51 Herden in Deutschland gewonnen und bakteriologisch durch Kultur untersucht. Parallel dazu wurden jeweils zwei Tankmilchproben von jeder Herde entnommen. Aus den Viertelgemelksproben wurden Tierpool- und für jede Herde zwei Herdenpoolproben erstellt. Die Tankmilch- und die Herdenpoolproben wurden mit einem kommerziellen qPCR Assay (Mastit 4A, DNA Diagnostic, DK) untersucht. Mit diesem qPCR-Assay konnten vier Erreger (Streptococcus (Sc.). uberis, Sc. agalactiae, Sc. dysgalactiae und Staphylococcus (S.) aureus) detektiert werden.
Auf Herdenebene wurden Prävalenzen von 70,6 % für S. aureus, 64,7 % für Sc. uberis und 47,1 % für Sc. dysgalactiae durch die BU der Viertelgemelksproben ermittelt. Sc. agalactiae fand sich nur in einer einzigen Herde, hier allerdings mit einer Intraherdenprävalenz von 32,6 %, und konnte deshalb in der weiterführenden Statistik auf Herdenebene nicht berücksichtigt werden. Um den Zusammenhang zwischen der scheinbaren Intraherdenprävalenz und dem Ct-Wert der Tankmilchuntersuchung zu prüfen, wurde für die untersuchten Erreger der Rangkorrelationskoeffizient berechnet. Für alle untersuchten Zusammenhänge auf Basis der ein- oder zweimaligen Tankmilch- bzw. Poolprobenuntersuchung konnte ein signifikanter Korrelationskoeffizient mit nur geringen Unterschieden zwischen den einzelnen Erregern ermittelt werden. Mit Hilfe eines logistischen Regressionsmodells wurden die Schwellenwerte der Intraherdenprävalenz berechnet, bei der eine Herde mit einer bestimmten Entdeckungswahrscheinlichkeit als positiv für den jeweiligen Erreger erkannt wurde. Eine Herde konnte durch eine einmalige qPCR-Tankmilchuntersuchung mit einer 90%-igen Entdeckungswahrscheinlichkeit als positiv für den jeweiligen Erreger erkannt werden, sobald eine scheinbare Intraherdenprävalenz von mindestens 27,6 % für Staphylococcus aureus, 9,2 % für Streptococcus dysgalactiae und 13,8 % für Streptococcus uberis vorlag. Durch die Verwendung von Herdenpoolproben anstelle von Tankmilchproben sanken die Schwellenwerte für die berechneten Entdeckungswahrscheinlicheiten in den meisten Fällen. Eine deutliche Reduzierung der Schwellenwerte konnte durch die Einbeziehung der Untersuchungsergebnisse beider Tankproben einer Herde erreicht werden. Im Ergebnis ist festzustellen, dass es zwar möglich ist, mittels qPCR-Tankmilchuntersuchung Mastitiserreger aufzuspüren, aber die einmalige Tankmilchuntersuchung kein ausreichend zuverlässiges Werkzeug darstellt. Eine regelmäßige Doppeluntersuchung der Tankmilch hingegen könnte ein wertvolles Überwachungsinstrument sein. Die Verwendung von Herdenpoolproben kann gegenüber der Verwendung von Tankproben von Vorteil sein. Allerdings steht der Nachteil der aufwändigen Erstellung dieser Proben in einem ungünstigen Verhältnis zu den Vorteilen.
Zur Evaluierung der qPCR auf Tierebene wurden 400 Milchproben aufgrund des Ergebnisses der BU zur Untersuchung ausgewählt. Zu jedem Erreger wurden 50 (Sc. agalactiae, dysgalactiae, S. aureus) bzw. 48 (Sc. uberis) BU-positive Tiere und 50 (Sc. agalactiae, dysgalactiae, S. aureus) bzw. 52 (Sc. uberis) BU-negative Tiere getestet. Als BU-positiv wurde ein Tier gewertet, wenn der Erreger in mindestens einer Viertelgemelksprobe nachgewiesen werden konnte. Als BU-negativ galten Tiere ohne Nachweis des jeweiligen Erregers, wenn diese aus Beständen stammten, in denen bei keinem Tier der Erreger detektiert wurde. Unter der Verwendung der BU mit Anreicherung als Goldstandard wurden für die Tierpoolprobenuntersuchung mittels qPCR für Sc. agalactiae und Sc. dysgalactiae Sensitivitäten von 96,0 % bzw. 94,0 % und Spezifitäten von 76,0 % bzw. 88,0 % ermittelt. Für den Nachweis von S. aureus und Sc. uberis zeigte die untersuchte qPCR-Methode Sensitivitäten von 70,0 % und 79,2 % und Spezifitäten von 98,0 % und 94,2 %. Mittels ROC-Analyse wurde berechnet, ob eine Verschiebung des Ct-Grenzwertes zu einer Optimierung der Güteparameter der qPCR führt. Eine Absenkung der Ct-Grenzwerte führte für Sc. agalactiae, S. aureus und Sc. dysgalactiae zur Verbesserung der Parameter, für Sc. uberis jedoch nicht. Für Sc. agalactiae wurde diese Optimierung durch eine Erhöhung der Spezifität und eine leichte Verringerung der Sensitivität erzeugt. Da es sich um einen hochkontagiösen Erreger handelt, ist eine reduzierte Sensitivität in der Praxis kritisch zu sehen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die PCR-Untersuchung der Tierpoolproben ähnliche Ergebnisse liefert wie die BU der Viertelgemelksproben. Durch die willkürliche Selektion der Proben in dieser Studie ist eine Verzerrung der Ergebnisse nicht auszuschließen. Die ermittelten Schätzwerte für die Güteparameter können aber als Vorabinformationen für weitere Evaluierungsstudien genutzt werden.