Einfluss von Seminalplasma auf die Motilität von gekühltem Hengstsamen nach einer hochkonzentrierten Lagerung

"Influence of seminal plasma on the motility of cooled stallion semen after a highly concentrated storage"

The aim of the present study has been the development of a semen processing method allowing the storage of equine semen at a high concentration of 333 million sperm/ml and low volume. Different seminal plasma concentrations were tested to achieve optimum spermatozoal motility. The quality of the new semen processing method (protocol 3) was evaluated by comparison with two standard conservation methods often used in the routine laboratory (protocol 1 + 2). Protocol 1 is one of the most commonly used semen processing methods due to its simplicity in implementation. The native semen was diluted directly after collection to 25 million sperm/ml. Protocol 2 is also a frequently applied standard semen conservation method. After dilution 1 + 1 with a semen extender and centrifugation at a force of 600 g for 10 min the bulk of the seminal plasma was removed. The sperm pellet was resuspended and diluted to a concentration of 25 million sperm/ml. Protocol 3 represents the new semen preservation method. The first steps were identical with protocol 2 and included a dilution 1 + 1, semen centrifugation at 600 g for 10 min and the removal of seminal plasma. Unlike protocol 2 the sperm pellet was then diluted to 333 million sperm/ml. Semen storage at that high concentration saves a volume up to 92.5 % compared with the two conventional semen processing methods. After storage the highly concentrated semen was diluted to a final concentration of 25 million sperm/ml. Various concentrations of seminal plasma were added to the extender to investigate the influence of seminal plasma on spermatozoal motility.
The study was conducted with 8 stallions of different breeds aged from 3 - 12 years. Six ejaculates of each stallion were used for the experiment. All semen preservation methods were performed with four different extenders. Semen storage took place at the standard temperature for cooled stallion semen at 5 °C. Sperm motility was evaluated subjectively after 0, 24 and 48 h of storage.
The present study demonstrates that highly concentrated semen can be used for artificial insemination. The new method is a suitable volume-saving alternative to the conventional semen preservation protocols. A small proportion of autologous seminal plasma in the insemination dose may be beneficial in regard to the multiple functions of seminal plasma in the female reproductive tract. Concerning the spermatozoal movement, there is in the majority of cases no difference between portions without seminal plasma and portions with a small amount of 5 or 20 %. Only a high concentration of 80 % seminal plasma should be avoided because of its negative influence on sperm motility.
From the extenders tested in this study, INRA 96 yielded the best results with regard to sperm motility. BotuSemen and Gent are also well suited for the shipment of equine semen, however they were most times inferior to INRA 96. EquiPro is the extender that preserves spermatozoal movement worst over a period of 48 h.
The study revealed great differences in semen quality among the individual stallions. Therefore it is recommendable to adapt the conservation method, the seminal plasma concentration and the extender type to the individual sire. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer Konfektionierungsform, die durch eine hohe Konzentrierung des Spermas auf 333 Mio. Spermien/ml einen volumensparenden Kühlsamenversand ermöglicht. Zum Erreichen einer optimalen Spermienmotilität wurden bei der Konfektionierung verschiedene SP-Konzentrationen getestet. Die Qualitätsbeurteilung der neuen Konfektionierung (Konfektionierung 3) erfolgte durch Vergleich mit zwei Standardmethoden der Samenaufbereitung (Konfektionierung 1 + 2). Konfektionierung 1 gehört aufgrund ihrer Simplizität in der Durchführung zu den am meisten angewendeten Samenaufbereitungsmethoden. Hier wurde der Samen nach der Gewinnung direkt auf 25 Mio. Spermien/ml verdünnt. Konfektionierung 2 gehört ebenfalls zu den traditionell häufig durchgeführten Methoden. Nach einer 1 + 1 Verdünnung mit einem Frischsamenverdünner und einer Zentrifugation des Samens bei 600 g für 10 min wurde der Großteil des Seminalplasmas entfernt. Das Spermienpellet wurde anschließend resuspendiert und auf 25 Mio. Spermien/ml verdünnt. Konfektionierung 3 stellt eine nach unserem Kenntnisstand bisher nicht beschriebene Methode der Samenaufbereitung dar. Wie auch bei der zweiten Konfektionierung wurde der Samen zunächst 1 + 1 verdünnt, bei 600 g für 10 min zentrifugiert und das SP größtenteils entfernt. Anschließend fand eine Resuspension des Spermienpellets und eine Verdünnung auf 333 Mio. Spermien/ml statt. Diese hohe Konzentration ermöglicht eine Volumeneinsparung beim Versand von bis zu 92,5 % im Vergleich zu den zwei herkömmlichen Methoden. Erst nach der Lagerung wurde der Verdünner hinzugegeben, so dass eine besamungsübliche Konzentration von 25 Mio. Spermien/ml entstand. Im zugefügten Verdünner waren verschiedene Seminalplasma-Konzentrationen enthalten, deren Einfluss auf die Spermienmotilität untersucht wurde.
Das Probandenkollektiv umfasste 8 Hengste verschiedener Rassen mit einem Alter von 3 - 12 Jahren, von denen jeweils 6 Samenproben für den Versuch aufbereitet wurden. Alle Konfekti-onierungen wurden parallel mit vier unterschiedlichen Frischsamenverdünnern durchgeführt. Die Lagerung der aufbereiteten Proben erfolgte, wie es für Versandsperma üblich ist, bei einer Temperatur von 5 °C. Nach 0, 24 und 48 h wurde die Spermienmotilität subjektiv beurteilt.
Die Untersuchungen belegen, dass die hochkonzentrierte Lagerung bei 333 Mio. Spermien/ml zur Konservierung von Hengstsperma geeignet ist und somit eine Alternative zu den herkömmlichen Samenaufbereitungsmethoden darstellt. Ein geringer Anteil an autologem Seminalplasma in der Besamungsportion kann von Vorteil sein in Hinblick auf die vielfältigen Funktionen des Seminalplasmas im weiblichen Genitaltrakt. In Bezug auf die Motilität hingegen lässt sich bei den meisten Hengsten kein Unterschied zwischen Proben ohne Seminalplasma im Verdünner und Proben mit einer geringen Seminalplasma-Konzentration von 5 oder 20 % feststellen. Nur ein hoher Seminalplasma-Anteil von 80 % führt zu einer negativen Beeinflussung der Spermienmotilität und sollte daher vermieden werden.
Von den im Versuch getesteten Verdünnern ist INRA 96 bei allen durchgeführten Konfektio-nierungen am besten in der Lage, die Spermienmotilität zu erhalten. Auch BotuSemen und Gent sind für die Kühlkonservierung gut geeignet, jedoch sind sie INRA 96 in der Regel etwas unter-legen. EquiPro führt von den vier Verdünnern nach 24 und 48 h zu der niedrigsten Spermien-beweglichkeit.
Die vorliegende Studie zeigt große Unterschiede in der Samenqualität zwischen den Hengsten. Zur Erzielung einer optimalen Spermienmotilität nach dem Versand ist eine Anpassung von Konfektionierungsmethode, SP-Anteil und Verdünner an die individuellen Bedürfnisse der einzelnen Hengste empfehlenswert.