Etablierung eines histologischen Protokolls zur intestinalen Mukusdarstellung sowie Untersuchungen des Einflusses unterschiedlicher Zinkaufnahmen auf den Mukus im Darm von Absetzferkeln

"Establishing a histological standard protocol for the depiction of intestinal mucus, and an examination of the influence of different zinc intakes on the mucus in the intestines of weaned piglets"

Promoting animal health is a central concern in scientific research, for economical as well as ethical reasons. In pig breeding, the period after weaning is particularly critical, especially with regard to intestinal health. Feeding the trace element zinc in amounts above the normally required level has been proven by scientific studies to be effective in preventing diarrhoea after weaning and has shown positive effects on food intake and weight gain as well as an effect on the mucus consistency in the colon.
Mucus is produced by goblet cells and is an important physical and immunological barrier to the epithelium of mucosa. As there are no studies to date about the effect of zinc on the thickness of the intestinal mucus layer, the aim of this thesis was to examine the effects of different alimentary zinc dosages on the mucus layer thickness, crypt depth of the intestinal mucosa in the colon and the expression of different mucus peptides in the jejunum and the colon of weaned piglets.
The histological description and quantification of the mucus is very difficult from a methodological point of view. In addition, there are a large number of standard protocols ranging from the usual histological fixation method to complex in vivo studies, so that the various results may not lend themselves to direct comparison. Therefore, the establishing of an optimised fixation and staining standard protocol for the intestinal mucus layer was another focus of this thesis.
The test animals were 24 healthy piglets, which had been weaned early and were between 25 and 38 days old. 12 were female, 12 male. The lactation period was 25 days on average. During the lactation period the piglets were offered no feed supplements. They were bred in climatized pig breeding stables with two piglets per bay. Three test groups of eight piglets (four males, four females each) were formed and given various amounts of zinc oxide (respectively: A = 0 mg ZnO per kg of feed, B = 100 mg ZnO per kg of feed, C = 1000 mg ZnO per kg of feed). During the two-week feeding period, feed and water were offered ad libitum. Immediately after putting the animals to death, specimens of the middle part of the jejunum and ascending colon were taken and instantly fixed by means of liquid nitrogen, or chemically by means of methacarn, and, for test purposes, of Carnoy’s and Bouin’s solutions.
Nitrogen fixed specimens were then dehydrated by means of a heating plate. Apart from direct staining on a trial basis, the histological frozen sections were, as a rule, postfixed before the staining using paraformaldehyde vapour (PFA), a 4% neutrally buffered formalin solution (4%NBF), ethanol, and other fixations. In the staining, Alcian blue, PAS, Alcian blue/PAS, haematoxylin-eosin, Astra blue and various lectins were compared.
In order to determine the thickness of the mucus layer, two methods were compared. Firstly, a "ten point measurement" was performed where the mucus layer thickness between the epithelium and the colon contents was measured at ten points, vertically to the epithelial layer. Secondly, the mucus area as a whole was calculated by forming a polygon and dividing the calculated area by the length of the mucosa underneath ("calculus / integral measurement").
Subsequently, the effect was examined which different doses of zinc in the feed of weaned piglets have on the mucus layer thickness and the crypt depth in the colon. Furthermore, the expression of MUC2, trefoil factor 3 as well as beta-defensin-3 mRNA were analysed by means of the reverse transcription quantitative PCR in the middle section of the jejunum and the ascending colon.
The results showed that the nitrogen freeze fixation resulted in reliable mucus preservation. When using methacarn, a detachment of the colon contents and the mucus layer from the intestinal epithelium could generally be observed. The comparison of the mucus layer thickness after nitrogen or after chemical fixation returned no differences. The decisive advantage of freeze fixation is the largely intact layering of: intestinal epithelium - mucus - colon contents. The postfixation of the freeze specimens proved necessary for the preservation of the mucus. The comparison of ethanol, 4% NBF and PFA as postfixations showed no differences between the measured mucus layer thicknesses. However, the choice of the subsequent postfixation had an effect on the description of the mucus. Unlike ethanol and 4% NBF, PFA displayed a laminar layering of the mucus in the colon which corresponds to the hitherto existing understanding of the mucus.
In the subsequent AB-PAS staining, a dependency of the mucus thickness on the different pH-values of the Alcian blue solution could not be detected. However, Alcian blue with a pHvalue of 2.5-PAS was preferred to Alcian blue with a pH-value of 0.5-PAS due to its complete solubility. The evaluation of the mucus layer thickness by means of the 10 point measurement vs. the calculus / integral measurement returned no effect either on the measurement results of the mucus layer. The calculus method based on the polygon is probably mathematically more precise and reduces the risk of result distortion.
The parameters of the favoured method can be defined as follows:
- use of weaned piglets with ad libitum feeding
- careful specimen-taking immediately post mortem
- use of freeze fixation of the intact colon by means of nitrogen, without rinsing the colon or preparing the tissue in any other way
- sectioning of specimens in the cryostat and mounting them on silanized slides preheated to 50°C
- drying of specimens on a heating plate (30 mins minimum at 50°C) and subsequent postfixation by means of paraformaldehyde vapour for 6 hours at 60°C in the incubator
- staining of histological specimens by means of Alcian blue pH 2.5-PAS and covering them with Roti-Histokit
- measuring and evaluating the mucus layer thickness by means of the "calculus / integral measurement".
In the jejunum, mucus could be described histologically by use of the favoured method. However, a morphometric layer thickness measurement was not feasible in this section of the colon because of interference with chyme. For further studies on the small intestine, the selection of a different colon segment or a targeted last feed for the purpose of a filled jejunum are conceivable.
Concerning the feeding of different doses of zinc, there was no effect on the mucus thickness, the crypt depth or the MUC2 expression. Regarding the crypt depth as a parameter for the number of goblet cells or the MUC2 expression as a parameter for the activity of the goblet cells, it seems plausible that the mucus layer thickness remained unaffected by different zinc contents. The MUC2 expression in the jejunum or the expression of trefoil factor 3 in the jejunum and the colon were not affected, either, by different zinc contents in the feed. Only the expression of beta-defensin-3 in the jejunum appeared tendentiously increased with a high zinc dosage. There is a striking variance in the measurements within the groups. As a consequence, this result can be considered as a coincidental effect of the dispersal of the measured data.
In this study, the mucus preservation proved dependent on the choice of the fixation method. Using freeze fixation with subsequent dehydration on a heating plate as well as postfixation by means of paraformaldehyde vapour led to reliable mucus preservation in the colon with reproducible results. Chemical fixations by means of methacarn or Carnoy's solution proved unsuitable. These studies might serve as a contribution to establishing a "Gold Standard" for the histological description of mucus in the colon of pigs.
The analysis of different zinc dosages in the feed returned no relation to the thickness of the mucus layer in the colons of weaners. The positive effects of zinc on the quantity of the secreted mucus may already be exhausted by feeding the normally required concentration. It is possible that zinc only has an effect on the quality and thereby the composition of the mucus. Die Förderung der Tiergesundheit ist aus ökonomischen sowie ethischen Aspekten ein zentrales Anliegen wissenschaftlicher Untersuchungen. In der Schweineaufzucht ist das Absetzen der Ferkel von der Sau eine besonders kritische Phase, insbesondere hinsichtlich der Darmgesundheit. Eine bedarfsüberschreitende Fütterung des Spurenelements Zink erwies sich in wissenschaftlichen Untersuchungen als wirksam gegen Durchfall nach dem Absetzen und zeigte positive Auswirkungen auf die Futteraufnahme und die Gewichtszunahme sowie Einfluss auf die Mukuszusammensetzung im Darm. Der Mukus wird von Becherzellen produziert und stellt eine wichtige physikalische und immunologische Barriere vor dem Schleimhautepithel dar. Da bisher keine Untersuchungen zu Auswirkungen von Zink auf die intestinale Mukusschichtdicke vorliegen, war das Ziel dieser Arbeit, den Effekt unterschiedlicher alimentärer Zinkdosen auf die Mukusschichtdicke und die Kryptentiefe der Schleimhaut im Kolon sowie der Expression verschiedener Peptide des Mukus im Jejunum und im Kolon von Absetzferkeln zu untersuchen. Die histologische Darstellung und Quantifizierung des Mukus ist aus methodischer Sicht äußerst schwierig. Zudem existiert eine Vielzahl von Nachweismethoden, deren Spektrum von den üblichen histologischen Fixierungsprotokollen bis zu aufwendigen in vivo-Untersuchungen reicht, sodass eine Vergleichbarkeit der jeweiligen Ergebnisse nicht uneingeschränkt möglich ist. Vor diesem Hintergrund war die Etablierung eines optimierten Fixierungs- und Färbeprotokolls zur intestinalen Mukusschichtdarstellung ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit.
Bei den Versuchstieren handelte es sich um 24 gesunde, früh abgesetzte Ferkel im Alter vom 25. bis 38. Lebenstag, davon 12 Tiere weiblich und 12 Börge. Die Säugeperiode betrug im Mittel 25 Tage. Während der Säugeperiode wurde den Ferkeln kein Ergänzungsfuttermittel angeboten. Die Aufzucht erfolgte in klimatisierten Ferkelaufzuchtställen (Vollspalten-Flatdeck) mit zwei Ferkeln je Einzelbucht. Es wurden jeweils acht Ferkel (vier Börge, vier weibliche Tiere) gleichmäßig auf drei Versuchsgruppen mit und ohne Zulage von Zinkoxid in unterschiedlichen Dosierungen aufgeteilt (A = 0 mg ZnO/kg Futter, B = 100 mg ZnO/kg Futter, C = 1000 mg ZnO/kg Futter). Die Aufzuchtperiode betrug zwei Wochen. Hierbei wurden ein Alleinfuttermittel sowie Wasser ad libitum angeboten. Unmittelbar nach der Tötung der Tiere wurden Proben des mittleren Jejunums und aszendierenden Kolons entnommen und umgehend physikalisch mittels flüssigem Stickstoff oder chemisch mittels Methacarn, probeweise auch mittels Carnoy und Bouin fixiert.
Stickstofffixierte Schnitte wurden anschließend mit einer Hitzeplatte dehydriert. Neben der probeweisen Durchführung von Direktfärbungen wurden die histologischen Gefrierschnitte in der Regel vor der Färbung mittels Paraformaldehyddampf (PFA), vierprozentiger neutral gepufferter Formalinlösung (4%NBF), Ethanol und weiteren Fixationen postfixiert. Bei der anschließenden Färbung wurden Alcianblau, PAS, Alcianblau-PAS, Hämatoxylin-Eosin, Astrablau und verschiedene Lektine verglichen.
Die Ermittlung der Mukusschichtdicke erfolgte einerseits über eine „Zehnpunktemessung“ senkrecht zum Epithel bis zum Darminhalt. Zum anderen wurde die Mukusfläche durch Bildung eines Polygons als Ganzes berechnet und die berechnete Fläche durch die Länge der darunter liegenden Schleimhaut dividiert („Integralmessung“).
Anschließend wurde die Auswirkung unterschiedlicher Zinkdosen im Futter von Absetzferkel auf die Schichtdicke des Mukus sowie die Kryptentiefe im Kolon untersucht. Darüber hinaus wurden die Expressionshöhen der mRNA von MUC2, Trefoil factor 3 sowie beta-Defensin 3 mittels qRT-PCR im mittleren Jejunum und im aszendierenden Kolon analysiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Gefrierfixierung durch Stickstoff zu einem zuverlässigen Mukuserhalt führte. Bei Verwendung von Methacarn waren in der Regel Ablösungen des Darminhalts sowie der Mukusschicht von der Darmwand zu beobachten. Der Vergleich der Mukusschichtdicke nach Gefrier- oder chemischer Fixierung ergab keinen Unterschied. Der entscheidende Vorteil der Gefrierfixierung lag in der überwiegend intakten Schichtung von Darmwand – Mukus – Darminhalt.
Die Postfixation der Gefrierschnitte erwies sich als notwendig für den Mukuserhalt. Der Vergleich von Ethanol, 4%NBF und PFA als Postfixationen ergab keinen Unterschied in den gemessenen Mukusschichtdicken. Dagegen hatte die Auswahl der anschließenden Postfixation einen Einfluss auf die Mukusdarstellung. PFA zeigte gegenüber Ethanol und 4%NBF eine laminare Schichtung des Mukus im Kolon, der dem bisherigen Verständnis des Schleims entspricht. In der anschließenden AB-PAS-Färbung wurde keine Abhängigkeit der Mukusdicke von unterschiedlichen pH-Werten der Alcianblaulösung nachgewiesen. Alcianblau pH 2,5-PAS wurde jedoch aufgrund der vollständigen Löslichkeit des Färbemittels gegenüber Alcianblau pH 0,5-PAS bevorzugt. Auch die Auswertung der Mukusschichtdicke mittels Zehnpunkte- bzw. Integralmessung ergab keinen Einfluss auf die Messergebnisse der Mukusschicht. Durch die Bildung eines Polygons ist die Integralmessung wahrscheinlich mathematisch präziser und verringert die Gefahr von Ergebnisverzerrungen.
Die Parameter für die favorisierte Methode lassen sich wie folgt definieren:
- Verwendung von Absetzferkeln bei ad libitum-Fütterung.
- Vorsichtige Probenentnahme unmittelbar post mortem.
- Verwendung der Gefrierfixierung des intakten Darmrohres durch Stickstoff, ohne Spülung des Darms oder andere Gewebepräparationen.
- Schneiden der Proben im Kryostaten und Aufziehen der Schnitte auf vorgewärmte (50 °C), silanisierte Objektträger.
- Trocknung der Schnitte auf einer Hitzeplatte (mindestens 30 min bei 50 °C) und anschließende Postfixation mittels Paraformaldehyddampf für 6 h bei 60 °C im Brutschrank.
- Färbung der histologischen Schnitte mittels Alcianblau pH 2,5-PAS und Eindecken mittels Roti-Histokitt.
- Messung und Auswertung der Mukusschichtdicke mittels „Integralmessung“.
Im Jejunum konnte Mukus auf diese Weise histologisch dargestellt werden. Allerdings war in diesem Darmabschnitt aufgrund mangelnder Begrenzung durch Chymus keine morphometrische Schichtdickenmessung möglich. Für weitere Studien am Dünndarm ist die Auswahl eines anderen Darmsegments oder eine gezielte letztmalige Fütterung zur Herstellung eines gefüllten Jejunums denkbar.
Hinsichtlich der Fütterung unterschiedlicher Zinkdosen wurde im Kolon kein Einfluss auf die Mukusdicke, die Kryptentiefe oder die MUC2-Expression nachgewiesen. Bei Betrachtung der Kryptentiefe als einen Parameter für die Anzahl der Becherzellen bzw. die MUC2-Expression als einen Parameter für die Aktivität der Becherzellen, erscheint plausibel, dass die Mukusschichtdicke von unterschiedlichen Zinkgehalten unbeeinflusst blieb. Die MUC2-Expression im Jejunum sowie die Expression von Trefoil factor 3 im Jejunum und im Kolon wiesen ebenfalls keinen Einfluss unterschiedlicher Zinkgehalte im Futter auf. Lediglich die Expression von beta-Defensin 3 im Jejunum zeigte sich bei hoher Zinkfütterung tendenziell erhöht. Auffällig ist die hohe Streuung der Messungen innerhalb der Gruppen. Dieses Ergebnis ist somit eher als zufälliger Effekt der Messdatenverteilung zu interpretieren.
In der vorliegenden Arbeit war der Mukuserhalt abhängig von der Auswahl des Fixierungsprotokolls. Die Verwendung der Gefrierfixierung mit anschließender Dehydration auf einer Hitzeplatte sowie Verwendung von Paraformaldehyddampf als Postfixation führte im Kolon zu einem zuverlässigen Mukuserhalt und ergab reproduzierbare Ergebnisse. Chemische Fixierungen wie Methacarn oder Carnoy waren für den Mukuserhalt nicht geeignet.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit könnten zur Etablierung eines „Goldstandards“ für die histologische Mukusdarstellung im Kolon von Schweinen beitragen.
Die Auswertung der Fütterung unterschiedlicher Zinkdosen zeigte keinen Einfluss auf die Mukusschichtdicke im Kolon von Absetzferkeln.