Untersuchung von pränatal induzierten Effekten durch die klassisch teratogene Substanz 5-Fluoro-2‘-deoxyuridine (FUDR) auf das Skelettsystem hinsichtlich ihrer postnatalen Persistenz bei Ratten

Assessment of postnatal persistence of prenatally induced effects on the skeletal system of rats after treatment with the classic teratogen 5-fluoro-2’-deoxyuridine (FUDR)

In developmental toxicology adverse effects of chemical substances on fetuses during in utero development are investigated. One important manifestation of such adverse effects are changes in skeletal development during organogenesis, which are generally called anomalies. During risk assessment of anomaly-inducing substances the classification of the findings into variation or malformation is crucial for their categorization as potential reproductive toxicant.
While a variation is characterized by a delay in development a malformation represents a permanent irreversible impairment which can affect postnatal survival or health. However, postnatal permanence cannot be assessed in routine studies on developmental toxicity as sacrifice and evaluation of fetuses are carried out one day before their calculated delivery. Furthermore, in part of the skeletal system, especially in the cervical column, development is completed postnatally. Few publications exist that address the topic of postnatal effects of substances. For the past three decades experts have emphasized the need for studies on postnatal consequences of fetal anomalies in order to reduce uncertainties regarding their classification. The aim of the present investigation is to contribute to clarification of the postnatal fate of skeletal anomalies in the vertebral column. For that purpose already processed skeletons of rat fetuses and offspring from earlier experiments with the substance 5-fluoro-20-deoxyuridine (FUDR) were assessed. FUDR is known to induce teratological effects and is frequently used as model substance in teratological studies. Dams in the treatment groups received a single subcutaneous dose of 35, 40, 45, 50, 55, 65 and 75 mg FUDR/kg body weight (bw) on day 11 of gestation. The control group was treated with the vehicle aqua dest. at a volume of 10 ml/kg bw. Offspring were sacrificed on gestational day 21 and on postnatal days 7 and 21. Subsequently animals were subject to the double-staining procedure with alcian blue and alizarin red. Evaluation of the skeletons was carried out with 4-fold magnification under a binocular microscope. All findings were assigned according to the updated internationally harmonized terminology. Based on the results obtained postnatally recommendation for classification of several anomalies were elaborated in the present study. We recommend the classification of the anomalies vertebra centrum unossified, vertebra centrum asymmetric ossification, vertebra centrum bipartite ossification, vertebra centrum hemicentric (with the exception of cervical vertebrae) as well as vertebra centrum misshapen (with the exception of lumbar vertebrae) as variations. The anomaly vertebra centrum dumbbell-shaped should be classified as malformation based on ist postnatal persistence. The same applies to the anomaly lumbar centrum supernumerary sinister/dexter/sinister+dexter which should also be classified as malformation.
The present study contributes to the reduction in uncertainty when it comes to the classification of skeletal anomalies in the vertebral column. Furthermore, it can be concluded from the results of the present study that the consideration of postnatal investigations on the developmental toxicity of substances can contribute markedly to the decrease of risk for human health. In der Entwicklungstoxikologie werden schädigende Wirkungen von chemischen Substanzen auf die Embryonen während der Entwicklung im Mutterleib untersucht. Eine wichtige Manifestation einer solchen Wirkung sind Veränderungen in der Skelettentwicklung während der Organogenese. Solche Veränderungen werden allgemein als Anomalien bezeichnet.
Bei der Risikobewertung von Substanzen, die solche Anomalien induzieren können, ist die Beurteilung ob diese Anomalie als Variation oder Missbildung klassifiziert werden kann, entscheidend für die Einstufung der jeweiligen Substanz. Während eine Variation durch eine Entwicklungsverzögerung gekennzeichnet ist, stellt eine Missbildung eine permanente irreversible Schädigung dar, die auch im späteren Leben zu Beeinträchtigungen führen kann. Die Beurteilung des Merkmals postnatale Permanenz ist jedoch in Routinestudien zur Entwicklungstoxizität nicht möglich, da die Tötung und Untersuchung der Feten kurz vor dem Wurftermin stattfindet. Darüber hinaus ist bei einem Teil des Skelettsystems, insbesondere im Bereich der Halswirbelsäule, die Entwicklung erst postnatal abgeschlossen. Es existieren nur wenige experimentelle Untersuchungen, die postnatale Wirkungen von Substanzen zum Thema haben. Bereits seit einigen Jahrzehnten wird von Experten betont, dass Untersuchungen zu postnatalen Konsequenzen von fetalen Anomalien dringend notwendig sind, um die Unsicherheiten bei ihrer Klassifizierung zu reduzieren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zur Klärung des postnatalen Schicksals von Skelettanomalien im Bereich der Wirbelsäule beizutragen. Dazu wurden bereits bearbeitete Skelette von Rattenfeten und Jungtieren aus früher durchgeführten Experimenten mit der Substanz 5-Fluoro-2‘-deoxyuridine (FUDR) untersucht. Bei FUDR handelt es sich um eine Substanz, die teratologische Effekte sicher induziert und daher als Modellsubstanz verwendet wird. Die Muttertiere der Behandlungsgruppen erhielten an Tag 11 der Gestation einmalig subkutan 35, 40, 45, 50, 55, 65 und 75 mg FUDR/kg Körpergewicht (KGW). Die Kontrollgruppe erhielt das Vehikel Aqua destillata in einem Volumen von 10 ml/kg KGW. Die Nachkommen wurden am Gestationstag 21, sowie an den postnatalen Tagen sieben und 21 getötet. Anschließend durchliefen die Tiere eine Knochen-Knorpel-Doppelfärbung mit Alcian Blau und Alizarin Rot. Die Auswertung der Skelette erfolgte bei vier-bis achtfacher Vergrößerung mit Hilfe eines Stereolupenmikroskops mit beleuchtetem Objekttisch (Firma Carl Zeiss, Jena). Alle Veränderungen wurden unter Beschreibung der Region und der Struktur dokumentiert. Die Befunde wurden entsprechend der aktuell gültigen Terminologie benannt. Auf Basis der postnatal gewonnenen Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten Vorschläge zur Klassifizierung einiger Anomalien erarbeitet werden. Es wird vorgeschlagen die Anomalien Vertebra centrum unossified, Vertebra centrum asymmetric ossification, Vertebra centrum bipartite ossification, Vertebra centrum hemicentric (außer in den Halswirbelkörpern, in welchen es als Missbildung klassifiziert werden sollte) sowie Vertebra centrum misshapen (außer in den Lendenwirbelkörpern, in denen sie bereits als Missbildung klassifiziert sind) als Variation zu klassifizieren. Der Befund Vertebra centrum dumbbell-shaped sollte auf Grund seiner in den postnatalen Ergebnissen ersichtlichen Permanenz als Missbildung klassifiziert werden. Gleiches gilt für die Anomalie Lumbar centrum supernumerary sinister/dexter/sinister+dexter, die ebenfalls als Missbildung klassifiziert werden sollte.
Die vorliegende Arbeit trägt wesentlich zur Reduzierung der Unsicherheit bei der Klassifizierung von skelettalen Anomalien im Bereich der Wirbelsäule bei. Weiterhin kann aus den Ergebnissen dieser Arbeit gefolgert werden, dass die Berücksichtigung von postnatalen Untersuchungen zu entwicklungstoxischen Wirkungen von Substanzen erheblich zur Verringerung des Risikos für den Menschen beitragen können.