Detection and characterization of lipopeptide-specific T cells in guinea pigs sensitized with bacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex

Der einzige, verfügbare Impfstoff gegen Tuberkulose – der Bacille Calmette-Guérin (BCG)-Impfstoff – schützt verlässlich vor schweren Formen der Tuberkulose im Kindesalter, aber nicht vor Lungentuberkulose bei Erwachsenen. Trotz vieler Versuche konnte bisher noch kein verbesserter, alternativer TB-Impfstoff zugelassen werden. Für die zukünftige Impfstoffentwicklung kann der weitere Erkenntnisgewinn über die stimulatorischen Antigene dieses Impfstammes und die durch sie hervorgerufenen Immunantworten entscheidend sein. Das Ziel der hier beschriebenen Studie war die Untersuchung der BCG-vermittelten adaptiven Immunantwort, die sich gegen Lipidpräparationen (Chloroform-Methanol-Extrakte, CME) von Bakterien des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes (MTC) richtet. Mit BCG sensibilisierte Meerschweinchen wurden als Modell für die BCG-Impfung im Menschen eingesetzt. Die hier vorliegende Studie befasst sich im Speziellen mit der Frage, ob Lipopeptide in CME-Präparationen relevante stimulatorische Antigene für die adaptive, zelluläre Immunantwort nach BCG-Impfung darstellen und ob die Expression von stimulatorischen Lipidantigenen innerhalb des Genus Mycobacterium variiert. Eine weitere Intention war, die molekulare Struktur der stimulatorischen Antigene in CME zu identifizieren. Auszucht-Dunkin-Hartley-Meerschweinchen wurden mit BCG oder – zu Vergleichszwecken – mit hitze-inaktivierter Feuchtmasse des virulenten M. bovis-Stamms AN5 sensibilisiert. Die ex vivo Proliferation von mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) wurde in einem auf CFSE-Färbung basierenden Proliferationsassay untersucht, der mittels Durchflusszytometrie analysiert wurde. In diesem Assay wurden CMEs von M. bovis BCG und M. tuberculosis H37Rv sowie zusätzlich ein Kochscher Alttuberkulin-Standard als antigene Stimuli verwendet. Die Untersuchung der molekularen Struktur der relevanten, stimulatorischen Antigene in diesen Präparationen erfolgte mit Hilfe von Delipidierung und Protease-Behandlung. Darüber hinaus wurden die stimulatorischen Potenziale von einer Lipopeptid-angereicherten CMEH37Rv-Subfraktion (LppEL), einem definierten, mykobakteriellen Protein-Antigen (AG85A) und verschiedenen BCGPräparationen (lebende oder Hitze-inaktivierte Bakterien, bakterielle Lysate von BCGKulturen in der exponentiellen als auch in der statischen Wachstumsphase, Kulturüberstand) im ex vivo-Lymphozytenproliferationsassay getestet. Ein Restimulationsassay, der auf der antigen-spezifischen Vermehrung von ex vivo Lymphozyten, der Sortierung der vermehrten Lymphozyten und der Restimulierung dieser Zellen basierte, wurde im Zuge dieser Studie etabliert und diente daraufhin zur Feststellung der Antigenspezifität der stimulierten Lymphozyten sowie zur Untersuchung der Verteilung der stimulatorischen Antigene in den verschiedenen, getesteten Präparationen (Tuberkulin, CMEBCG, CMEH37Rv, LppEL). Die Verteilung der stimulatorischen Antigene wurde zusätzlich innerhalb des Genus Mycobacterium unter Verwendung von CMEs von verschiedenen MTC-Stämmen, einschließlich klinischer, (M. bovis AN5, M. tuberculosis CDC 1551, Haarlem 2336, HN 878, Beijing 1934, East African-Indian strains 1797 and 91/0079, M. canetti), und CMEs von nichttuberkulösen Mykobakterien (NTM) (M. marinum, M. avium ssp. avium and M. avium ssp. paratuberculosis, M. leprae, M. fortuitum) untersucht. Es wurde angestrebt, die molekulare Struktur der stimulatorischen Antigene in den Lipidpräparationen durch zwei komplementäre Ansätze zu identifizieren: Aufreinigung von Lipopeptiden aus angereicherten Präparationen mittels Umkehrphasen-Chromatographie und Untersuchung des stimulatorischen Potenzials von synthetischen, N-terminalen Peptiden von M. tuberculosis-Lipoproteinen. Die durchflusszytometrische Auswertung des ex vivo-Lymphozytenproliferationsassays zeigte, dass Meerschweinchen starke adaptive Lymphozytenreaktionen nach Sensibilisierung mit sowohl BCG als auch inaktiviertem, virulentem M. bovis AN5 entwickeln. Die Lymphozyten proliferierten nach Stimulierung mit CME-Präparationen von M. bovis BCG und M. tuberculosis H37Rv. Die CMEBCG-stimulierte Proliferation war ähnlich stark wie die durch Tuberkulin hervorgerufene Lymphozytenreaktion und wurde durch ca. 45 % nur noch schwach CFSE-gefärbte Lymphozyten aus BCG-sensibilisierten Meerschweinchen repräsentiert. Diese Proliferation war signifikant stärker als die Lymphozytenreaktion auf das definierte mykobakterielle Protein-Antigen AG85A (p ≤ 0.0001, Students t-Test). Jedoch stimulierten die oben aufgeführten Präparationen von BCG-Bakterien ebenfalls eine starke Proliferation (signifikant über 20 % CFSE-schwache Zellen, p ≤ 0.001, t-Test mit einer Stichprobe). Die CMEBCG-reaktiven Lymphozyten waren vorwiegend (ca. 83 %) CD4-positive T-Zellen. Delipidierung als auch Protease-Behandlung von CMEBCG verminderte das stimulatorische Potenzial signifikant (p ≤ 0.0001, Students t-Test) zu Medianwerten unter 20 % CFSE-schwachen Zellen. Den gleichen Effekt auf die ex vivo Lymphozytenproliferation hatte die Delipidierung als auch die Proteinase K-Behandlung von Tuberkulin. Weiterhin zeigte sich eine ähnlich starke mediane Lymphozytenproliferation wie in der Reaktion auf die ursprüngliche CMEH37Rv-Präparation, wenn ex vivo PBMCs mit der Lipopeptid-angereicherten Subfraktion von CMEH37Rv (LppEL) stimuliert wurden. Die beiden proliferativen Reaktionen waren positiv korreliert (r = 0.64, Spearman-Korrelation). Es konnte unter Verwendung des Restimulationsassays bestätigt werden, dass die proliferierenden T-Zellen spezifisch auf in Tuberkulin, CMEBCG, CMEH37Rv als auch in LppEL vorhandene Antigene reagierten. Starke Proliferation (im Mittel signifikant über 20 % CFSE-schwache Zellen, p ≤ 0.05, t-Test mit einer Stichprobe) ließ sich jedoch ausschließlich als Reaktion auf CME-Präparationen von MTC-Bakterien beobachten. Im Gegensatz dazu überstieg die mittlere proliferative Reaktion auf CME-Präparationen von NTM die 20-%-Grenze nicht signifikant (p > 0.05). Bis zum jetzigen Zeitpunkt war es nicht möglich, einzelne Lipopeptide, welche die beobachtete, starke Lymphozytenproliferation ausmachten, zu identifizieren. Es ist jedoch bemerkenswert, dass einige synthetische N-terminale Peptide von M. tuberculosis-Lipoproteinen (LprG, PstS3, LppW, LprL, Pitlp und LppD) im Mittel oder in einzelnen Meerschweinchen stärkere Lymphozytenproliferation stimulierten. Die Ergebnisse zeigen, dass das Meerschweinchen für Studien über adaptive Immunantworten auf MTC-Bakterien geeignet ist und im Speziellen ein gutes Modell zur Untersuchung der BCG-Impfung unter definierten experimentellen Bedingungen darstellt. Alle Ergebnisse spiegeln die Beobachtungen in M. tuberculosis-infizierten Menschen wider. Starke Evidenz für das stimulatorische Potenzial und die Relevanz von Lipopeptiden in den CME-Präparationen wurde durch drei unabhängige, immunologische Ansätze geliefert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Lipopeptide einen Großteil des stimulatorischen Potenzials nicht nur von CME, sondern auch von Kochschem Alttuberkulin ausmachen. Die Daten unterstützen die Annahme, dass BCG starke Antigene, wie z.B. die mutmaßlichen Lipopeptide, in großen Mengen exprimiert und freisetzt. Die vermuteten Lipopeptide werden anscheinend spezifisch innerhalb des Mycobacterium-tuberculosis- Komplexes exprimiert oder erkannt; in nicht-tuberkulösen Mykobakterien jedoch nur selten. Die Identifizierung einzelner starker Lipopeptid-Antigene bedarf weiterer Untersuchungen. In diesem Zusammenhang ist in Betracht zu ziehen, dass zur Stimulierung von ähnlich starken Lymphozytenreaktionen, wie sie nach Inkubation mit komplexen, Lipopeptid-haltigen Antigengemischen, wie z.B. CME, beobachtet wurden, gegebenenfalls Antigengemische verschiedener, starker Lipopeptid-Einzelantigene benötigt werden, deren Existenz die hier beschriebenen Ergebnisse nahelegen.