Magnetresonanztomographischer semiquantitativer Nachweis von kontrastmittelmarkierten mesenchymalen Stammzellen in chondralen Defekten am Kniegelenk des Hundes

Trotz vielfältiger Anwendung von Stammzelltherapien am lebenden Organismus ist der Verbleib und die biologische Aktivität der Stammzellen in vielen Fällen noch ungeklärt (Edelman et al. 2006, Tobias et al. 2012). Das Einbringen von mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte zählt zu den favorisierten Therapiekonzepten in der Regeneration von hyalinem Knorpel und ist zentraler Gegenstand vieler aktueller Forschungsvorhaben (Liu et al. 2002, Guo et al. 2004, Lopez-Laguna et al. 2011, Thiede et al. 2012).
Die in - vivo Visualisierung von implantierten Stammzellen mittels Magnetresonanztomographie stellte eine nicht invasive Methode zur Erlangung weiterer Erkenntnisse über den Verbleib und Wirkmechanismus der Zellen dar.
In dieser Arbeit wurden die aus dem Fettgewebe gewonnen Stammzellen fünf junger Hunde isoliert und in einem standardisierten Verfahren mit Eisenoxidpartikeln (Endorem®, 308 µg Fe / ml) markiert. Anhand der Berliner Blau Färbung, sowie einer Elektronenmikroskopischen Betrachtung wurde die Markierungseffizienz sowie die zellinterne Verteilung bewertet. In verschiedenen in - vitro Versuchen erfolgte die Untersuchung der potenziell negativen Einflüsse der Markierung auf die Zellvitalität, das Proliferationsverhalten sowie die Migrationsfähigkeit der Zellen. Nicht markierte Zellen derselben Stammzellspender dienten hierbei als negativ Kontrollgruppe.
Anschließend wurden die Zellen in eine Kollagenmatrix eingebracht und zusammen mit dieser in den zuvor geschaffenen standardisierten Knorpeldefekt im Kadaver-Kniegelenk implantiert. Es erfolgt die MRT Untersuchung im 1 Tesla Tomographen und Auswertung der gemessenen Signalintensitäten in der T2* FFE gewichteten Sequenz. Parallel wurden in einem weiteren Schritt labortechnisch die in - vitro Verträglichkeit und Anwendbarkeit des Zwei - Komponenten Kollagengels und seine Auswirkungen auf die Stammzellen evaluiert.
Es konnte gezeigt werden, dass die verwendete Endorem® - Konzentration von 308 µg Fe / ml Medium und das 24 h Inkubationsprotokoll zu einer ausreichenden Markierungseffizienz der kaninen Stammzellen führte. Des Weiteren wurden in - vitro für diese Konzentration keine negativen Einflüsse der Markierung auf die biologischen Eigenschaften und die evaluierten Parameter der Stammzellen nachgewiesen. Hierfür wurden die Zellen einer Phalloidin Färbung, einer TEM Untersuchung, einem MTT Test unterzogen sowie mittels Life Cell Imaging untersucht. Der MTT Test zeigt mit einer Signifikanz von p = 0,014 (p = 0,0034), dass Endorem® interindividuell keinen nachweisbar negativen Einfluss auf die Zellproliferation hat. Die Studie weist jedoch in den in vitro Untersuchungen zu Wachstum und Proliferation deutliche Kulturunterschiede in den Zellpopulationen der verschiedenen Spender auf. Im Pearson Korrelationstest ergeben sich eine hohe Korrelation (r = 0,87 MTT, r = 0,94 Life Cell Imaging) für den Zusammenhang zwischen den verwendete Stammzellpopulationen und der jeweiligen Proliferations- und Migrationskapazität.
Die verschiedenen Zellpopulationen bewiesen in beiden Tests hoch signifikanten (p = 0,0012 MTT, 0,0008 Life Cell Imaging) einen stärkeren Einfluss auf die Proliferation und Migration, im Vergleich zu den Auswirkungen der Endorem® - Markierung.
Bei der Evaluation der Verträglichkeit und Unschädlichkeit des Kollagengels zeigten sich in vitro exzellente Ergebnisse für die Zellvitalität und Migration innerhalb und außerhalb des Gels. Einzig die Verarbeitung des Gels im Bereich des Knorpeldefektes erwies sich auf Grund von Lufteinschlüssen in der späteren MRT - Untersuchung als nachteilig.
Die subjektiv vom Untersucher ausgewerteten T2* FFE gewichteten Aufnahmen bewiesen eine verlässliche Detektion der markierten Stammzellen im artifiziell geschaffenen Knorpeldefekt des Kniegelenkes (im Bereich 0,00 – 10.00 x 105 Zellen / ml). Mit steigender Zellkonzentration konnte eine invers proportionale, signifikante Abnahme der Signalintensität in der gemessenen Region of Interest (ROI) nachgewiesen werden (p = 0,016).
Das eisenoxidhaltige Kontrastmittel Endorem® stellt somit in Kombination mit einem kollagenen Trägermaterial eine optimale Basis zum Nachweis von implantierten Stammzellen in der MRT dar. Die hier gewonnen Ergebnisse ermöglichen einen zukünftigen effektiven und kontrollierten klinischen Einsatz der Stammzellen am Tier und bieten die Möglichkeit, Wirkmechanismus und Verbleib der Zellen weiter zu erforschen.