Bedeutung der morphometrischen Variationen und des Protamingehaltes von Spermatozoen in Korrelationzur Fruchtbarkeit bei Warmbluthengsten

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung, ob mit Hilfe der computergestützten, morphometrischen Analyse von Spermien und der molekular biologischen Analyse der Kernkondensation die Fertilität eines Hengstes prädiktiv beurteilt werden kann. Für die Untersuchungen standen am Anfang der Saison 2009 insgesamt 55 Warmbluthengste im Alter zwischen 3 und 19 Jahren zur Verfügung. Es wurde eine spermatologische Standarduntersuchung der Ejakulate und eine morphometrische Untersuchung mit Hilfe des Computerprogramms ISAS durchgeführt. Darüber hinaus erfolgte die Bestimmung der Spermienchromatinintegrität nach dem „flow cytometric of acridine orange test“ (FCAOT) Verfahren. Durch die Verwendung von qPCR spezifischen Primern, angepasst an die genomische Sequenz der Pferde, konnte die Expression in Hodengewebe und Ejakulat der 55 Hengste , Protamin-1 und zwei Varianten von Protamin-2 (Protamin-2 und Protamin-3), erfolgreich nachgewiesen werden. Bei der Verwendung von spezifischen monoklonalen Antikörpern konnte die stadien-spezifische Expression des Protamins-1 während der physiologischen Spermatogenese nachgewiesen werden. Durch den Einsatz von den generierten Antikörpern gegen humanes Protamin- 2 konnte in den Gewebeschnitten der Hengste kein Protamin-2 nachgewiesen werden. Dies beweist jedoch nicht den Mangel an Protamin-2, sondern die niedrige Affinität der Antikörper und ihrer Erkennung der Epitope für das Protamin-2 der Hengste. Basierend auf den Fertilitäsparametern NRR 28% (non-return-rate in Prozent) Werten wurden die Hengste in drei Quartile unterteilt: Das erste Quartil (n=14) ent- spricht der Hengstgruppe mit niedriger, das zweite und dritte Quartil (n=27) der mit mittlerer und das vierte Quartil (n=14) der mit hoher Befruchtungsleistung. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede der Furchtbarkeit in Bezug auf das Lebensalter der Hengste festgestellt werden (Durchschnitt 8,05±4,8 Jahre). Bei der statistischen Auswertung ergaben sich folgende Ergebnisse: Hengste mit hoher durchschnittlicher Befruchtungsleistung (Quartil 3) (272,07±64,5 Millionen von Spermien pro Milliliter MioS/ml) wiesen eine niedrigere Spermienkonzentration auf, verglichen mit den Hengsten mit niedriger Befruchtungsleistung (Quartil1) (336,14±123,2 MioS/ml) (p-Wert= 0,076). Die Spermienkonzentration zeigte auch einen Unterschied zwischen den Hengsten der Quartile 1 und 2 (p=0,022). Im Hinblick auf die Untersuchung der anderen spermatologischen Standardparameter wurde in der vorliegenden Studie bei den untersuchten Hengsten eine positive Korrelation zwischen der Fertilität und der Morphologie dargestellt. Die Fruchtbarkeit stand mit den anderen untersuchten Spermienparametern, Volumen und progressiver Motilität, in keinem Zusammenhang. Die morphometrische Untersuchung der Spermien zeigte Unterschiede in der Länge der Spermienköpfe zwischen den Gruppen (1 vs. 2: p=0,036), (1 vs. 3: p=0,049). Es wurde keine Signifikanz zwischen den Gruppen 2 und 3 festgestellt (p=0,071). Auch zeigte sich kein Unterschied im Perimeter, in der Breite und Area der Spermienköpfe in den verschiedenen Gruppen. Bei der Untersuchung der DNS-Integrität wurde ein Durchschnitt von ca. 5% DFI in der gesamten Hengstpopulation festgestellt. Ein relevanter statistischer Unterschied zwischen den drei Fertilitätsgruppen konnte bei der Auswertung nicht festgestellt werden. In der gesamten Population der 55 Hengste variierte die relative Expression von Protamin-1 zwischen 10,1-8,6 und Protamin-2 zwischen -2-5,6. Die Analyse der Ratio beider Protamine ergab einen Bereich zwischen -6,4-11,2. In Gruppe 1 (Hengste mit niedriger Fertilität) lag der Durchschnitt der P1/P2-Ratio bei 1,5±4,5. Die statistische Auswertung ergab einen signifikanten Unterschied im P2/P1- Verhältnis zwischen den Gruppen 1 und 3 (p=0,014). Auffallend ist, dass der signifikante Unterschied nur für die Expression der Protamine-1 (p=0,019) nachgewiesen werden konnte, nicht jedoch für die Protamine- 2 (p=0,049) im Vergleich der Gruppen 1 und 3. Die Untersuchungen zeigten eine deutliche Korrelation zwischen Fertilität (NRR 28%) und der relativen Expression von Protamin-1 (correlation co-efficiency p=0,019), sowie eine positive Korrelation zwischen Fertilität und P1/P2-Ratio (correlation co-efficiency p=0,017). Die vorliegende Studie zeigt, dass die Protamin-1-mRNA-Expression ein wertvoller Parameter zur Beurteilung der Chromatin-Kondensation des Spermatozoenkerns beim Hengst darstellt. Das P2/P1-mRNA-Verhältnis korreliert positiv mit der NRR 28. Die besten Fertilitätsraten von 90 bis 100% (NRR 28%) wurden bei Hengsten erzielt, deren Spermien ein P2/P1-mRNA-Verhältnis zwischen 6 bis 10 aufwiesen. Die Studie verdeutlicht, dass das P2/P1-mRNA-Verhältnis als sinnvoller prädiktiver Fruchtbarkeitsparameter beim Hengst verwendet werden kann.