Eignung eines neuartigen Hydrogels zur zellbasierten Therapie chondraler Defekte im Knie von Minipigs

Eignung eines neuartigen Hydrogels zur zellbasierten Therapie chondraler Defekte im Knie von Minipigs Institut für Veterinär-Pathologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig Forschungszentrum für Experimentelle Orthopädie, Zentrum für Orthopädie, Unfallchirurgie und Paraplegiologie, Universitätsklinikum Heidelberg Eingereicht im Dezember 2014 94 Seiten, 33 Abbildungen, 26 Tabellen, 236 Literaturangaben, 3 Seiten Anhang Schlüsselwörter: Knorpeldefekt, Hydrogel, Chondrozyten, Minipig, zellbasierte Therapie Einleitung Nicht behandelte Knorpelschäden führen langfristig zum Verschleiß des Gelenks – der Arthrose. Eine vielversprechende Möglichkeit zur Behandlung von Knorpelschäden ist die Matrix-assoziierte Chondrozytenimplantation. Hierbei werden Knorpelzellen in einem Trägermaterial in die Defektstelle eingebracht. Das Trägermaterial soll helfen, die Zellen im Defekt zu fixieren und eine initiale Matrix bieten, die den implantierten Zellen den Aufbau des neuen Knorpels ermöglicht. Ziele der Untersuchungen In der vorliegenden Dissertationsarbeit sollte die neuartige Matrix NOVOCART® Inject der Firma TETEC® auf ihre Eignung für die Therapie von Knorpeldefekten untersucht und ihre potentiellen Effekte im Vergleich zu dem bereits in der klinischen Anwendung befindlichen Biomaterial Fibrin charakterisiert werden. Des Weiteren wurde der Verbleib der transplantierten xenogenen Chondrozyten und deren Beitrag zur Regeneration von Knorpeldefekten bestimmt. Material und Methoden Für diese Studie wurden bei insgesamt 12 Göttinger Minipigs jeweils zwei vollschichtige Defekte (Ø 6mm) auf den medialen Femurkondylen beider Knie gesetzt (n = 48 Defekte) und mit humanen Chondrozyten, die entweder in NOVOCART® Inject oder Fibringel eingebettet waren, gefüllt. Zellfreie Träger dienten jeweils als Kontrolle (n = 6). Nach zwei und vier Wochen wurde die Defektfüllung, Biokompatibilität, Wirtszellanlockung und der Verbleib der implantierten Zellen sowie die Regeneratqualität histologisch und auf Genexpressionsebene evaluiert. Die Defektfüllung wurde mittels histomorphometrischer Analyse bestimmt. Um die Biokompatibilität der Trägermaterialien zu bewerten, wurde zunächst die Genexpression von proinflammatorischen Zytokinen (IL-1ß, IL-6, TNF-α), des Pan-Leukozyten- (CD45) sowie eines Makrophagenmarkers (S100A9) in den exzidierten Regeneraten bestimmt. Rekrutierte Makrophagen und Wirtszellen sowie persistente xenogene Zellen konnten im Regenerat immunhistologisch bzw. per in-situ-Hybridisierung nachverfolgt und histomorphometrisch quantifiziert werden. Dank der in-situ-Hybridisierung konnten die transplantierten xenogenen Chondrozyten auch ohne vorheriges Zelllabeling im Implantat nachverfolgt werden. Darüber hinaus wurde die Persistenz der xenogenen Chondrozyten anhand der Expression des human-spezifischen HPRT-Gens im Regenerat überprüft und die isolierte genomische DNA mittels PCR auf humanspezifische Sequenzen (AluYb8) hin untersucht. Die Regeneratqualität wurde anhand mehrerer Kriterien bewertet. Hierzu zählen der Nachweis der Gen- und Proteinexpression des Knorpel-spezifischen Kollagens Typ II via RT-PCR und Immunhistologie, die qualitative Auswertung der Defekte mittels modifiziertem O’Driscoll Score und die histomorphometrische Quantifizierung der Defektfüllung. Die Statistik der Vorstudie wurde mittels T-Test (n = 9), die histologischen Auswertungen in der Hauptstudie mittels Kruskall-Wallis-Test (n = 6) und die Auswertung der Genexpressionsdaten mittels Wilcoxon-Test (n = 6) berechnet. Als signifikant wurde ein p-Wert von < 0,05 definiert. Ergebnisse In der vorliegenden Studie konnte nachgewiesen werden, dass NOVOCART® Inject auch ohne Membranabdeckung eine gute Defektfüllung erzielt und für mindestens vier Wochen im Defekt verbleibt. Das neue Hydrogel ist biokompatibel und weist keine signifikant erhöhten Entzündungszeichen gegenüber Fibringel auf. Des Weiteren konnte eine vergleichbare Regeneratqualität durch den Einsatz von NOVOCART® Inject im Vergleich zu dem bereits klinisch eingesetzten Fibringel im porzinen Tiermodell erreicht werden. Unsere Ergebnisse zeigen ferner, dass unabhängig vom verwendeten Trägermaterial, xenogen transplantierte Zellen im vorliegenden Defektmodell nur kurzfristig überdauern und deren Beitrag zur Knorpelregeneration folglich geringer einzuschätzen ist als der der wirtseigenen Zellen. Wir fanden Hinweise auf eine Immunreaktion unter Beteiligung von Makrophagen, die ursächlich für das Verschwinden der implantierten Zellen sein könnten. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen stellen folglich die häufig diskutierte Theorie des immunpriviligierten Status der Chondrozyten in Frage. Die Untersuchungen zur Expression und Ablagerung von Kollagen Typ II zeigten, dass die implantierten Zellen nur in sehr eingeschränktem Maße zur Defektheilung beitragen und das gebildete Regeneratgewebe fast ausschließlich durch Wirtszellen aufgebaut wird. Schlussfolgerungen NOVOCART® Inject stellt eine vollwertige Alternative zu dem bereits in der Klinik in Anwendung befindlichen Trägermaterial Fibrin dar. Der Vorteil auch ohne Membranabdeckung eine gute Fixierung im Defekt zu erreichen, lässt auf eine beachtliche Erleichterung und Zeitersparnis bei der Durchführung der Operation schließen. In dieser Arbeit wurde erstmals die Frage nach dem Verbleib der implantierten Zellen durch die Methode der in-situ-Hybridisierung gestellt, die sich als sehr geeignet erwies. Die vorliegende Studie legt nahe, dass im xenogenen Modell die Problematik der Abstoßungsreaktion gegen die transplantierten Zellen nicht zu unterschätzen ist. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse stehen demzufolge im Widerspruch zu Studien, die Chondrozyten und den artikulären Knorpel als kaum immunogen bezeichnen. Um die Regeneratqualität weiterführend bewerten zu können, wäre es von Interesse, zu Standzeiten von sechs und zwölf Wochen analoge Untersuchungen durchzuführen.