Identifizierung und Charakterisierungvesikulärer Strukturen im caninen Ejakulatsowie Untersuchungen zu derenfunktioneller Bedeutung

Bei vielen Spezies, darunter Mensch, Bulle, Pferd und Schwein, sind vesikuläre Strukturen als Bestandteil des Ejakulats schon lange Gegenstand der Forschung. Nach Beginn dieser Arbeit wurden zwei Studien publiziert, die sich erstmals mit Vesikeln aus dem caninen Ejakulat beschäftigten. Während vor allem beim Menschen zahlreiche Funktionen der Vesikel im Rahmen der Spermienphysiologie bekannt sind und man auch bei anderen Spezies von einem bedeutenden, vesikulären Einfluss auf die Fortpflanzungsprozesse ausgeht, ist der Kenntnisstand beim Rüden sehr gering. Dieser Hintergrund war Hauptmotivation für die vorliegende Arbeit, deren Ziel es war, grundlegende Erkenntnisse über den vesikulären Aufbau zu erlangen. Darüber hinaus sollten ein möglicher, gewinnbringender Einsatz im Rahmen der Kryokonservierung der Spermienzellen und damit die vesikuläre Funktion untersucht werden. Hierfür wurden Ejakulate von 35 Rüden (31 normosperme Rüden, 2 Rüden mit Hypokinozoospermie, 1 Rüde mit Pathospermie und 1 Rüde mit Azoospermie) lichtmikroskopisch (n=35), elektronenmikroskopisch (n=18), mittels SDS-PAGE (n=14), MALDI-TOF-MS-Analyse (n=6), HPTLC mit nachfolgender Iodfärbung und Densitometrie (Bestimmung der Phospholipide, n=14) und Cholesterol-Assay-Kit (n=12) untersucht. Außerdem wurden Spermienproben von 10 normospermen Rüden ohne (Gruppe 1) oder mit (Gruppe 2) Vesikeln tiefgefroren oder nach dem Auftauen mit Vesikeln versetzt (Gruppe 3). Zu den Zeitpunkten 0, 10 und 30 Minuten nach dem Auftauen erfolgte eine spermatologische Untersuchung mittels Lichtmikroskopie, CASA, HOS-Test, Eosin-Färbung (Lebend-/Tot-Verhältnis) und Spermac®®-Färbung (Spermienmorphologie). In einem zweiten Versuchsteil wurden Spermienproben nach dem Auftauen unterschiedliche Vesikelmengen zugesetzt (0,05, 0,1 und 0,2 mg Vesikelprotein/ml) und die Ergebnisse der spermatologischen Untersuchung (0, 10 und 30 Minuten nach dem Auftauen) mittels Lichtmikroskopie und CASA verglichen. Das Vorkommen der Vesikel im Ejakulat des Rüden konnte bei allen 35 Probanden unabhängig von deren Fertilitätsstatus lichtmikroskopisch bestätigt werden. Ultrastrukturell wurde die canine Vesikelpopulation anhand von morphologischen Kriterien in 11 Vesikeltypen eingeteilt, die sowohl bei fertilen als auch bei infertilen Rüden (Hypokino- und Azoospermie, n=3) nachweisbar waren. Unterschiede zwischen fertilen und infertilen Gruppen ergaben sich im maximalen Vesikeldurchmesser (Normospermie: Mittel: 195 nm; Spannweite: 25-3289 nm, n=15; Hypokinozoospermie: Mittel: 196 nm; Spannweite: 21-2096 nm, n=2; Azoospermie: Mittel: 204 nm; Spannweite: 22-1314 nm, n=1) und in der Verteilung der Vesikeltypen. Es bleibt abzuklären, ob die morphologisch unterschiedlichen Vesikeltypen auch funktionell unterschiedlich sind und ob ein Zusammenhang der Vesikelverteilung zur Fertilität besteht. Durch Nachweis von Vesikeln im Ejakulat eines Kastraten (Rüde 35) konnte belegt werden, dass zumindest ein Teil der Vesikel seinen Ursprung in der Prostata hat. Die caninen Vesikel zeigten ein komplexes Protein- und Lipidmuster. Im Unterschied zu den Spermien, bei denen prominente Proteinbanden nach elektrophoretischer Auftrennung bei etwa <15 kDa und 25 kDa lagen, zeigten sich in den Vesikeln deutliche Proteinbanden im Bereich von etwa 17 and 40 kDa. Die Proteine Aktin und S100A9 wurden als vesikuläre Bestandteile identifiziert. Cholesterol, Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin und Phosphatidylcholin wurden aus Vesikelproben isoliert und quantitativ gemessen (xˉ geom x* SF±1: 0,078 x* 3,02 ±1 µg Cholesterol/µg Vesikelprotein, Spannweite: 0,009-0,244 µg Cholesterol/µg Vesikelprotein, n=11 bzw. 0,200 x* 1,83 ±1 µg Phosphatidylethanolamin/µg Vesikelprotein, Spannweite: 0,060-0,500 µg Phosphatidylethanolamin/µg Vesikelprotein, n=14 bzw. 0,076 x* 1,73 ±1 µg Sphingomyelin/µg Vesikelprotein, Spannweite: 0,021-0,200 µg Sphingomyelin/µg Vesikelprotein, n=14 bzw. 0,052 x* 2,17 ±1 µg Phosphatidylcholin /µg Vesikelprotein, Spannweite: 0,009-0,160 µg Phosphatidylcholin/µg Vesikelprotein, n=14). Dabei dominerte quantitativ Phosphatidylethanolamin, was im Unterschied zu Vesikeln anderer Spezies steht, bei denen Sphingomyelin das Hauptphospholipid ist. Interessant wäre hier eine qualitative und quantitative Erforschung der weiteren vesikulären Lipidbestandteile, um die Bedeutung der einzelnen Strukturen genauer einschätzen zu können. Die Untersuchung der Wirkung der Vesikel auf Tiefgefriersperma (Parameter Motilität, Membranintegrität, Vitalität) ergab kontroverse Ergebnisse, die vermutlich durch methodisch erzeugte Artefakte (Dichtegradientenzentrifugation mittels Silikatmedium; zu niedrige Vesikelkonzentration) zu erklären sind. So zeigte sich bei Spermienproben, die vor der Kryokonservierung mit Vesikeln versetzt worden waren im Vergleich zu vesikelfreien Spermienproben und solchen, denen Vesikel erst nach dem Auftauvorgang zugesetzt worden waren, ein positiver Einfluss auf das Bewegungsmuster der Spermien in Form von signifikant höheren Werten der CASA-Parameter DAP (p=0,0107), DCL (p=0,0456), DSL (p=0,022), VAP (p=0,0053), VCL (p=0,0375) und VSL (p=0,0112), jedoch gleichzeitig ein knapp nicht signifikant erhöhter Anteil an immotilen Samenzellen (p=0,0555) und ein signifikant erhöhter Anteil an toten Spermien (p=0,0005). Bei Zugabe von Vesikeln zu vesikelfreien Spermienproben nach dem Auftauvorgang fielen keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe auf. Jedoch wurde in einem konzentrationsabhängigen, zweiten Versuchsteil, in dem vesikelfreie Spermienproben mit einer unterschiedlichen Vesikelmenge nach dem Auftauen versetzt wurden, eine Wechselwirkung zwischen Vesikelkonzentration und Zeit deutlich. Spermienproben niedriger, vesikulärer Konzentration (0,05 mg Vesikelprotein/ml) wiesen zum Zeitpunkt 0 und insbesondere 10 Minuten nach dem Auftauvorgang eine höhere progressive Motilität (subjektive und objektive Vorwärtsbeweglichkeit; p=0,0176 bzw. p=0,0072) auf als die Versuchsgruppen höherer Vesikelkonzentration (0,1 mg Vesikelprotein/ml bzw. 0,2 mg Vesikelprotein/ml). Dagegen lagen die Mittelwerte des subjektiv und objektiv geschätzten Anteils der Vorwärtsbeweglichkeit in den Spermienproben 30 Minuten nach dem Auftauvorgang in Gruppe 3 (0,2 mg Vesikelprotein/ml) deutlich höher als diejenigen der anderen Gruppen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass wichtige Erkenntnisse zur grundlegenden, vesikulären Struktur, dem vesikulären Ursprung und erste Hinweise auf einen positiven, vesikulären Einfluss auf die Spermienzellen bzw. genauer deren Bewegungsmuster gewonnen wurden Wichtige Informationen, vor allem bezüglich einer möglichen Spermien-Vesikel-Interaktion und deren Bedeutung in der caninen Reproduktionsphysiologie, fehlen jedoch bislang. Daher sollten sich zur Erforschung der offenen Fragen weitere Untersuchungen anschließen, um die gewonnenen Daten zu ergänzen.