Altersabhängige Effekte auf inflammatorische Mediatoren und zentralnervös kontrollierte Krankheitssymptome bei systemischen Entzündungsreaktionen der Ratte

Im Altern kommt es zu komplexen Veränderungen des Immunsystems, welche sich dahingehend äußern, dass ältere Personen mit einer erhöhten Infektionsrate, einer verstärkten Krankheitssymptomatik und einer erhöhten Mortalitätsrate auf eine Infektionskrankheit reagieren. Das sogenannte „sickness behaviour“ umfasst zentralnervös kontrollierte Krankheitssymptome, welche im Rahmen eines systemischen Entzündungsgeschehens auftreten. Mit Ausnahme der Fieberreaktion, welche in den meisten Fällen erniedrigt oder nicht vorhanden ist, sind die meisten dieser Symptome im Alter verstärkt ausgeprägt. Das Vorliegen einer subklinischen, chronischen Entzündungsreaktion (ohne vorherigen Kontakt mit einem entzündungsauslösenden Immunstimulus) sowohl peripher (Blut, periphere Organe) als auch zentral im Gehirn wird mittlerweile als eines der Hauptmerkmale des Alterns angesehen. Bisher waren die meisten Studien darauf beschränkt, Abweichungen in den Zytokinleveln zu untersuchen, ohne Veränderungen in den unterliegenden immunoregulatorischen Signalwegen näher zu beleuchten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine tiefergehende Untersuchung der Veränderungen in den inflammatorischen Signalwegen unter Berücksichtigung von inflammatorischen Transkriptionsfaktoren, Enzymen der Prostaglandinsynthese sowie von anderen potentiell implizierten Faktoren wie oxidativen Stressmarkern und neuen endogen regulatorischen Molekülen, den microRNAs, unternommen. Neben den erwähnten inflammatorischen Markern rücken jedoch mittlerweile auch verstärkt andere Faktoren in den Fokus, die ebenfalls einen Einfluss auf die immunbedingten Veränderungen haben könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde der potentielle Einfluss anderer altersassoziierter Zustände untersucht. Dazu gehörten erhöhte Plasmalevel des zytokin-ähnlichen Hormons Leptin, welches auch als neuroimmuner Mediator bekannt ist, und altersassoziierter Adipositas auf die im Alter beobachteten Veränderungen der „sickness response“. Als therapeutischer Ansatz wurde der Effekt des antiinflammatorischen Wirkstoffes Rosiglitazon auf die Entzündungsreaktion untersucht. Abschließend wurde ebenfalls der mögliche Einfluss dieser inflammatorischen Veränderungen auf die altersbedingte Dysregulation der HPA-Achse und die Auswirkung auf Stress-induzierte Reaktionen analysiert. Alte und junge Ratten wurden mit LPS (100 µg/kg) oder PBS intraperitoneal injiziert und das „sickness behaviour“ mittels telemetrischer Methoden aufgezeichnet. Nach einem Zeitintervall von 4 oder 24 h wurden Blut, Gehirn und Leber für molekularbiologische und immunhistochemische Analysen entnommen. Zur weiteren Charakterisierung der Einflussgröße von Leptin auf die altersbedingte Entzündungsreaktion wurden die endogenen Leptinlevel durch Applikation eines Leptin Antiserums (LAS) vor LPS-Injektion neutralisiert. In einer dritten Studie wurde Rosiglitazon vor LPS- oder PBS-Stimulation verabreicht, um die therapeutische Anwendbarkeit dieses Wirkstoffes und zugrundeliegende Mechanismen zu untersuchen (altersbedingter mitochondrialer Stress). Die Beteiligung der altersassoziierten Adipositas an der Produktion von zirkulierenden Zytokinen wurde über Messung der LPS-induzierten Zytokinsekretion ex vivo entnommener Fettdepots von jungen und alten Ratten („fat explants“) überprüft. Altersbedingte Veränderungen in der HPA-Achse wurden über drei verschiedene Methoden untersucht: (1) Immunhistochemische und molekularbiologische Analyse von Hypophysen LPS- oder PBS-stimulierter Ratten, (2) Messung des Zytokinüberstandes nach Stimulation des Hypophysenvorderlappens in der Zellkultur mit LPS / PBS in Kombination mit verschiedenen Zytokin-Antiseren und (3) Einsatz eines psychologischen Stressors in einem in vivo Versuch. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass alte Ratten nach LPS-Stimulation nicht nur eine verzögerte, sondern sogar eine länger andauernde Fieberreaktion aufweisen. Dass alte Ratten überhaupt Fieber entwickeln, lag vermutlich an der hier eingesetzten höheren Umgebungstemperatur (28 °C). Diese Feststellung unterstützt Ergebnisse aus einer früheren Studie, dass die teilweise beschriebene erniedrigte oder ausbleibende Fieberreaktion im Alter mit einer beeinträchtigten Kapazität der Thermoeffektoren zusammenhängt. Außerdem wurde eine verstärkte Ausprägung der weiteren Parameter des „sickness behaviours“ (Lethargie, Anorexie, Adipsie, Gewichtsverlust) in den alten Ratten dokumentiert. Bei den alten Ratten wurden erhöhte Plasmawerte der Zytokine IL-6 und IL-1ra nachgewiesen, welche somit wahrscheinlich eine Rolle bei der verstärkten Ausprägung der Krankheitssymptomatik spielen. Zum ersten Mal konnte hier auch eine länger andauernde Erhöhung der Leptin Plasmalevel bei alten Ratten gezeigt werden, welches Hinweise auf eine bedeutendere Beteiligung von Leptin an der Fieberantwort im Altern liefert. Im Gehirn wurde eine erhöhte Expression verschiedener inflammatorischer Transkriptionsfaktoren (I?Ba, NF-IL6), Zytokine (IL-6), Enzyme der Prostaglandinsynthese (COX2, mPGES) und oxidativer Stressmarker (NRF1, TFAM) nachgewiesen und somit eine genauere Aufschlüsselung der unterliegenden Signalwege erreicht. Erstmalig konnte auch eine altersbedingte Erhöhung der antiinflammatorischen microRNA mir146a im Gehirn gezeigt werden, welche einen neuen Kandidaten zur Erklärung altersbedingter Veränderungen in der Immunantwort darstellt. Des Weiteren konnten wir mittels LAS demonstrieren, dass die erhöhten LPS-induzierten Leptin-Plasmalevel im Alter einen Einfluss auf die verlängerte und somit altersspezifische Fieberphase haben, während der Einfluss auf die Anorexie und Gewichtsabnahme bei den jungen Ratten größer war. Neutralisation endogener Leptin-Level hatte bei den alten Ratten einen starken Effekt auf die zirkulierenden IL-1ra-Level, welcher bei den jungen Ratten nicht vorhanden war. Somit scheint Leptin im Alter durchaus eine größere aber auch andere Rolle als bei jungen Tieren bei der Aufrechterhaltung der Fieberreaktion zu spielen. Die Untersuchung zu altersassoziierter Adipositas deutet darauf hin, dass das Fettgewebe auch bei alten Ratten nicht als einziger Entstehungsort der peripheren Inflammation in Frage zu kommen scheint, da die gewonnenen Ergebnisse lediglich eine tendenzielle Erhöhung der IL-6-Sekretion jedoch eine Erniedrigung der TNFa- und IL-1ra-Sekretion pro g Fettgewebe im Alter dokumentieren. Somit wurden Unterschiede zu bisher bekannten Befunden aus Studien zu diät-induzierter Adipositas und der hier untersuchten altersassoziierten Adipositas nachgewiesen. Die angewandte Methodik der akuten Rosiglitazon-Gabe stellte sich als ungeeignet für eine ausreichende antiinflammatorische Wirkung und Aktivierung entsprechender Targetproteine heraus. Lediglich in der Leber konnte eine Erhöhung der basalen PGC-1a und TFAM Expression (junge Ratten) sowie eine Erniedrigung der IL-10 Plasma Konzentration (alte Ratten) nachgewiesen werden. Im Gehirn war keiner der untersuchten Parameter durch die zweitägige Rosiglitazon-Behandlung beeinflusst. Nach den vorliegenden Erkenntnissen sollte in zukünftigen Studien demnach eine chronische Verabreichung dieses Wirkstoffes bevorzugt werden. In zentralen Schaltstellen (Median Eminence und Hypohysenhinterlappen) der HPA-Achse wurde eine verstärkte Aktivierung des inflammatorischen Transkriptionsfaktors NF-IL6 und von CD68-positiven immunkompetenten Zellen (nur Hypophysenhinterlappen) bei alten Ratten nachgewiesen. Während die verstärkte NF-IL6 Aktivität in der Median Eminence nur nach LPS-Stimulation auftrat, konnte diese verstärkte Immunreaktivität beider Faktoren im Hypophysenhinterlappen sowohl basal als auch nach Immunstimulus gezeigt werden. Des Weiteren wurde im Hypophysenhinterlappen eine verstärkte Kolokalisation der NF-IL6 Signale mit CD68-positiven Zellen beobachtet. Zusätzlich führte eine LPS-Stimulation von Zellkulturen des Hypophysenvorderlappens zu mit jungen Ratten vergleichbarer Sekretion von IL-6 und TNFa. Allerdings konnten bei gleichzeitiger Gabe von Antiseren gegen IL-10 und IL-6 keine Mechanismen einer Gegenregulation wie bei jungen Ratten nachgewiesen werden. Außerdem zeigten alte Ratten eine deutlich längere Erhöhung der Körpertemperatur nach dem psychologischen Stressor „Käfigwechsel“ als junge Ratten. Insgesamt fanden wir neue Hinweise darauf, wie die inflammatorischen Veränderungen im Alter sich ebenfalls auf die Aktivierung der HPA-Achse auswirken und damit zu einer verminderten Stressresistenz beitragen könnten. Zu diesen Hinweisen zählen: (A) die Veränderungen in den Regulationsmechanismen des Zytokinmilieus auf Ebene des Hypophysenvorderlappens, (B) die verstärkte Hyperthermie der alten Ratten nach psychologischem Stress (C) sowie die verstärkte NF-IL6-Aktivierung in der Hypophyse und im Hypothalamus. Über eine umfangreiche Analyse der zu Grunde liegenden inflammatorischen Signalwege auf zentraler und peripherer Ebene trägt diese Arbeit zu einer weiteren Aufschlüsselung der immunologischen Veränderungen und der implizierten inflammatorischen Faktoren beim Altern bei. Neben wesentlichen bekannten Faktoren, welche in früheren Studien untersucht wurden, analysierte das gegenwärtige Forschungsprojekt neue Kandidaten-Moleküle (z.B. mir146a) und deren potentielle Bedeutung. Außerdem konnte zum ersten Mal eine altersspezifische Rolle des Fettgewebes und des Hormons Leptin für die beobachteten Veränderungen im Gehirn und peripheren Organen bei systemischen Entzündungsreaktionen nachgewiesen werden. Zudem wurden Hinweise auf eine Resistenz der Zytokininteraktion und weitere immunologische Veränderungen im Alter gesammelt, die die Aktivierung der HPA-Achse und die Stressresistenz im Alter beeinflussen könnten. Diese Zusammenhänge wurden bisher in der Literatur kaum untersucht und die gezeigten Ergebnisse regen zu einer weiterführenden Untersuchung der hieraus neu entwickelten Hypothese an.