Peptid-Mikroarray-basierte serologische Diagnose und Typisierung von Toxoplasma gondii-Infektionen bei Menschen und Katzen in Deutschland

Toxoplasmose ist eine weltweit sehr häufig auftretende parasitäre Zoonose. Toxoplasma (T.) gondii ist in der Lage, nahezu alle homoiothermen Lebewesen (Säugetiere und Vögel) zu infizieren (Dubey 2010). Dieses Protozoon weist eine klonale Populationsstruktur auf, die in Nordamerika und Europa aus drei dominierenden klonalen Linien (I, II und III) besteht. Rekombinante und solche Genotypen von T. gondii, die nicht den drei klonalen Linien zugeordnet werden können („atypische“ Isolate), kommen in Südamerika sehr häufig vor. In Europa und Nordamerika werden diese nur selten beobachtet (Su, Khan et al. 2012, Walzer und Boyle 2012). Es wird diskutiert, ob der Krankheitsverlauf einer Toxoplasmose durch die T. gondii-Linie beeinflusst wird, mit der ein Mensch oder Tier infiziert ist (Gilbert, Freeman et al. 2008, McLeod, Boyer et al. 2012). Im Allgemeinen verläuft die Toxoplasmose bei immunkompetenten Menschen und Tieren meist klinisch unauffällig. Typ I-, rekombinante und viele atypische T. gondii-Stämme rufen bei Mäusen und eventuell auch bei Menschen eine deutlich schwerwiegendere klinische Symptomatik hervor, als T. gondii der klonalen Typen II oder III (Gilbert, Freeman et al. 2008, Dubey 2010). Die Mehrzahl der in Europa beim Menschen isolierten T. gondii sind dem klonalen Typ II zuzuordnen (Ajzenberg, Banuls et al. 2002, Ajzenberg, Banuls et al. 2004, Demar, Ajzenberg et al. 2007). Es ist epidemiologisch und eventuell auch klinisch relevant, bei einer Infektion den T. gondii- Genotyp zu identifizieren. Der Genotyp könnte einen möglichen Risikofaktor bei klinischen Toxoplasmosen darstellen und die Ergebnisse der Typisierung könnten dabei helfen, die richtigen Wege bei der Behandlung von klinischen Toxoplasmosen einzuschlagen. Um T. gondii einer klonalen Linie zuordnen zu können, gibt es neben der Bestimmung des Genotyps mit Nukleinsäuren-basierten Methoden auch die Möglichkeit, eine Serotypisierung durchzuführen (Kong, Grigg et al. 2003, Sousa, Ajzenberg et al. 2008, Sousa, Ajzenberg et al. 2009, Sousa, Canada et al. 2010). Zur Bestimmung des T. gondii-Serotyps, mit dem ein Tier oder ein Mensch infiziert ist, können T. gondii-Typ-spezifische polymorphe Peptide eingesetzt werden. Für die Untersuchung von Humanseren ist dieses Verfahren bereits in Form von ELISA-Tests verwendet worden (Kong, Grigg et al. 2003, Morisset, Peyron et al. 2008, Sousa, Ajzenberg et al. 2008, Sousa, Ajzenberg et al. 2009). Die serologische Ermittlung des klonalen Typs, mit dem ein Tier oder Mensch infiziert ist, basiert auf dem Nachweis von Antikörperreaktionen gegen Epitope, die polymorph und für die klonalen Typen I, II oder III spezifisch sind (Kong, Grigg et al. 2003). In Deutschland gab es bislang keinerlei Informationen über die Verbreitung bestimmter T. gondii-Geno- bzw. Serotypen bei Menschen und es standen nur im begrenzten Umfang Daten über die Prävalenz unterschiedlicher T. gondii-Genotypen bei Katzen zur Verfügung (Schares, Vrhovec et al. 2008, Herrmann, Pantchev et al. 2010). Die vorliegende Arbeit diente dazu, Serotypisierungstests auf einer Peptid-Mikroarray- Plattform zu entwickeln und diese für eine serologische Typisierung von T. gondii-Infektionen bei serologisch positiven Menschen und Katzen in Deutschland einzusetzen. Zusätzlich wurde geprüft, ob bioinformatisch vorhergesagte Epitope in einem Peptid-Mikroarray zur serologischen Diagnose einer T. gondii-Infektion bei Menschen eingesetzt werden können. Epitop-tragende Peptide wurden auf Mikroarray-Slides aufgetragen und die Arrays anschließend in einem ELISA-ähnlichen System eingesetzt, um in den Seren natürlich infizierter Menschen sowie in Seren experimentell- oder natürlich-infizierter Katzen Antikörper gegen diese Epitope nachzuweisen (Nahtman et al., 2007). Peptid-Mikroarrays ermöglichen es, im Mikrotiterformat, d.h. mit wenigen Mikrolitern Serum, mehrere Tausend Peptide gleichzeitig auf ihre Eignung zur Diagnose oder Typisierung zu untersuchen. Für die serologische Typisierung von T. gondii-Infektionen bei Menschen wurden insgesamt 54 polymorphe genotypspezifische Peptide, die bereits mit Humanseren geprüft worden waren (Kong, Grigg et al. 2003), im neuen Mikroarray-Format eingesetzt. Für die Serotypisierung der T. gondii-Infektionen bei Katzen, wurden 54 bereits publizierte polymorphe Peptide (Kong, Grigg et al. 2003) sowie weitere 47 polymorphe genotypspezifische Peptide, die mit Hilfe einer sogenannten „propensity scale“-Methode identifiziert worden waren, in einem neuen Peptid-Mikroarray-Test eingesetzt. Für die serologische Diagnose wurden insgesamt 20 potentielle Epitope mit Hilfe eines bioinformatischen Programmes namens ABCpred für die Analyse ausgewählt und die entsprechenden Peptide synthetisiert. Außerdem wurden 18 veröffentlichte Peptide auf ihre Reaktivität mit T. gondii-positiven Humanseren untersucht. Die Antikörperantwort gegen diese Peptide wurde bei Menschen und Katzen erfasst und die Prävalenz der T. gondii -Typ-spezifischen Antikörper-Reaktionen geschätzt.