Untersuchungen zur geno- und phänotypischen Charakterisierung der aviär pathogenen E. coli (APEC)-Mutante M12A09, die eine Transposoninsertion im Gen pyrD trägt

Die am hoch pathogenen APEC-Stamm IMT5155 (O2:K1:H5) durchgeführte STM von Li et al. (2005) lieferte zahlreiche Mutanten mit Defekten in Genen, die zu einem attenuierten Phänotyp im Infektionsmodell mit 5 Wochen alten Hühern führten (100, 102). In dieser Arbeit werden erstmals die Ergebnisse der geno- und phänotypischen Charakterisierung einer dieser Mutanten aufgeführt.
Nach diesen Untersuchungen handelt es sich bei M12A09 um einen Abkömmling des Stammes IMT5155 mit einer Transposon-Insertion in einem Gen der de novo Biosynthese der Pyrimidine, pyrD, wie durch Multiplex-PCR, PFGE-Restriktionsmuster, DNS-DNSHybridisierungen und arbitrary PCR demonstriert. Durch Genexpressions-Analysen mittels reverser Transkriptase-PCR konnte die fehlende Transkription von pyrD in Hühnerserum und LB-Medium nachgewiesen werden.
Die Untersuchungen zur Etablierung eines Phänotyps ergaben, dass die Mutante ohne weiteres in LB wachsen und sogar mit dem Wildtyp um die darin enthaltenen Nährstoffe konkurrieren kann. Der auxotrophe Charakter von M12A09 äußert sich jedoch in M9+ und in hitzeinaktiviertem Hühnerserum durch die fehlende und verminderte Vermehrung der Mutante. Dieses Wachstumsdefizit konnte durch externe Zufuhr von 750 μg/ml Orotat kompensiert werden. Weiterhin könnte nachgewiesen werden, dass erst durch das Wiedereinführen des intakten pyrD-Gens und eines ca. 700 bp großen Abschnitts stromaufwärts des Gens auf einem low-copy Plasmid der Phänotyp des Wildtypstammes in M9+ wieder hergestellt werden kann.
Die Verwendung des Embryonen-Letalitätstests (ELA) als adäquates Medium zur Klassifizierung von Mutanten nach ihrer Pathogenität konnte in dieser Studie für die auxotrophe Mutante M12A09 nicht bestätigt werden, da die Charakterisierung der Virulenz im zuverlässigen Hühnerinfektionsmodell ergab, dass M12A09 zwar eine Infektion verursacht, allerdings deutlich milder im Vergleich zum Wildtyp. Nach den Ergebnissen des ELA ist die Mutante M12A09 jedoch als hoch pathogen einzustufen. Dies konnte im bereits etablierten Hühnerinfektionsmodell nach der intratrachealen Applikation von ca. 2,5 x 10 (hoch 8) CFU nicht bestätigt werden. Während die Inokulation des Wildtyps zu den klassischen Anzeichen der APEC-Infektion mit hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden, Todesfällen und typischen Organläsionen post mortem führte, zeigten sich die Tiere, die die Mutante bekamen weitgehend ungestört und die pathologische Untersuchung belegte einen abgeschwächten Infektionsprozess. Somit ist die Mutante M12A09 mit einem defekten pyrDGen nach dieser Studie als attenuierter Erreger einzustufen, dessen protektive Eigenschaften weiter untersucht werden sollten.