Molekularbiologische Methoden 2.0 (eBook)

Vorwort zur 1. Auflage12
Vorwort zur 2. Auflage13
Vorwort zur 3. Auflage13
1 Das Leben und seine Bestandteile
1.1 Der Aufbau von DNA und RNA17
1.2 Der genetische Code20
1.3 Die Gene22
1.3.1 Die Genstruktur in Prokaryoten22
1.3.2 Genstruktur in Eukaryoten 24
1.4 Proteine 26
1.5 Die Zelle30
2 Grundlagen der Arbeit im Labor
2.1 Wasser34
2.2 Messung des pH-Werts35
2.3 Puffer36
2.4 Waagen36
2.5 Mikropipetten38
2.6 Gefäße im Labor40
2.7 Zentrifugen41
2.8 Mischen und Konzentrieren44
2.8.1 Konzentrieren45
2.8.2 Pufferwechsel 45
2.9 Probenlagerung46
2.10 Steriles Arbeiten46
2.11 Geräte für den Aufschluss von Geweben49
2.12 Pflege und Aufzucht von Escherichia coli51
2.12.1 Nährmedien52
2.12.2 Antibiotika53
2.12.3 Lagerung von Bakterien55
3 Aufreinigung von Nukleinsäuren
3.1 Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen59
3.1.1 Nukleasen59
3.1.2 Scherkräfte60
3.1.3 Chemische Verunreinigungen60
3.1.4 EDTA und zweiwertige Ionen: das Yin und Yang der Molekularbiologie61
3.2 Extraktion von Nukleinsäuren62
3.3 Die weitere Aufreinigung der DNA64
3.3.1 Phenolextraktion64
3.3.2 Ethanolfällung65
3.3.3 Isopropanolfällung67
3.3.4 PEG-Fällung 68
3.3.5 Entfernen von Polysacchariden mit CTAB68
3.3.6 Tropfendialyse68
3.4 Silica Matrices69
3.4.1 Von Nukleinsäuren und Silica Matrices69
3.4.2 Übersicht über den Einsatz von Kits70
3.5 Ausgewählte DNA Aufreinigungsverfahren71
3.5.1 Die Plasmidpräparation aus E. coli 71
3.5.2 Die Isolation von DNA aus Pflanzen mit CTAB72
3.5.3 Isolation von DNA aus Blut oder Zellkulturen74
3.5.4 Isolation hochmolekularer DNA75
3.6 Die Isolation von RNA76
3.7 Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren78
3.8 Quantifizierung von Nukleinsäuren79
3.8.1 DNA-Bestimmung im Photometer79
3.8.2 Konzentrationsbestimmung mittels optischer Dichte81
4 Polymerase-Kettenreaktion
4.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion85
4.2 Die Komponenten der PCR86
4.2.1 Die Ausgangs-DNA86
4.2.2 Thermostabile DNA-Polymerasen 86
4.2.3 Puffer, Magnesium und dNTPs89
4.2.4 Primer91
4.3 Geräte für die PCR93
4.4 Die Standard-PCR94
4.5 Ausgewählte PCR-Methoden94
4.5.1 Two-Step PCR94
4.5.2 Gradienten-PCR und Touch-Down PCR96
4.5.3 Nested PCR97
4.5.4 Multiplex PCR97
4.5.5 Einführen von Restriktionsschnittstellen98
4.5.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)99
4.5.7 Kolonie-PCR102
4.5.8 Quantitative PCR103
4.6 Anwendungen der PCR105
4.7 Optimierung der PCR-Reaktion105
5 Klonieren für Einsteiger
5.1 Restriktionsenzyme109
5.1.1 Restriktionsenzyme des Typs II110
5.1.2 Restriktionsenzyme im Labor113
5.1.3 Methylasen und Typ IIM-Enzyme115
5.1.4 Typ IIS-Enzyme116
5.2 Ligation116
5.3 (De)Phosphorylierung von DNA118
5.3.1 Dephosphorylierung118
5.3.2 Phosphorylierung 119
5.4 Enzyme für spezielle Aufgaben 121
5.5 Die Transformation von E. coli 121
5.6 Der Weg zum klonierten Gen 123
5.7 Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor123
5.7.1 Die Klonierung über eine Restriktionsstelle124
5.7.2 TA-Klonierung und TOPO-Cloning 125
5.7.3 Klonierung in ein Letal-Plasmid 126
5.7.4 Zyklische Blunt End Klonierung 126
5.8 Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor 127
5.9 Wenn es mal nicht klappt129
6 Vektoren
6.1 Plasmide 132
6.2 Klonierungsplasmide135
6.2.1 Blau-Weiß-Screening135
6.2.2 Letalvektoren138
6.3 Expressionsplasmide 139
6.3.1 Promotoren für Expressionsvektoren140
6.3.2 Weitere regulative Sequenzen141
6.3.3 Expression in das Periplasma141
6.3.4 Einschlusskörperchen [Inclusion Bodies]141
6.3.5 Tag-Sequenzen142
6.4 Reportergene142
6.5 Phagen 146
6.6 Phagemide147
6.7 Shuttle-Vektoren147
6.8 Künstliche Chromosome: YACs, BACs und PACs148
6.9 Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem149
6.9.1 Hefe als Modellorganismus149
6.9.2 Vektoren für Hefe151
6.9.3 Transformation von Hefe152
6.10 Pflanzen als Bioreaktoren 152
6.10.1 Die Transformation von Pflanzen153
6.10.2 Transiente Transformationsverfahren155
6.11 Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen156
6.11.1 Säugetiere als Modellorganismen 156
6.11.2 Säuger-Zellkulturen157
6.11.3 Vektoren für tierische Zellen158
6.11.4 Transfektion tierischer Zellkulturen159
7 Elektrophorese und Hybridisierung von Nukleinsäuren
7.1 Agarose-Gelelektrophorese von DNA162
7.2. Die Detektion der DANN im Gel167
7.3 Präparative Agarosegele169
7.4 Auftrennen von RNA im Agarosegel170
7.5 Fehlersuche bei Agarose-Gelelektrophorese170
7.6 Hybridisierung von Nukleinsäuren171
7.6.1 Southern und Northern Blot173
7.6.2 Herstellung der Sonde und Hybridisierung174
7.7 Microarrays174
8 Fortgeschrittene Klonierung
8.1 Klonsammlungen und synthetische Gene179
8.1.1 Klonsammlungen180
8.1.2 Synthetische Gene undGenfragmente 180
8.2 Rekombinase-basierte Klonierung 181
8.3 Mutageneseverfahren 183
8.4 PCR-basierte Klonierungsverfahren: RF-Cloning und oePCR186
8.5 Synthetische Biologie188
8.6 Biobricks189
8.7 Nahtlose Klonierungsverfahren189
8.7.1 Golden Gate Klonierung190
8.7.2 Cut-Ligation Verfahren191
8.7.3 Multiple Insertionen mittels Golden Gate Klonierung192
8.7.4 Golden Gate basierte Tool Kits am Beispiel des MoClo Kits192
8.8 Gibson Assembly195
9 Proteinaufreinigung
9.1 Homogenisation203
9.1.1 Proteasen204
9.1.2 Phenoloxidasen206
9.2 Extraktion von Proteinen207
9.2.1 Homogenisationspuffer 207
9.2.2 Abtrennen von Zell- und Gewebetrümmern208
9.2.3 Fraktionierung des Rohextrakts 208
9.3 Dialyse und Konzentrierung211
9.4 Weitere Aufreinigungsschritte212
9.4.1 Chromatographie213
9.4.2 Chromatographische Trennprinzipien215
9.4.3 Magnetic Beads216
9.5 Quantifizierung von Proteinen217
9.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford217
9.5.2 BCA-Test219
9.5.3 Welchen Test benutzen? 220
9.6 Aufreinigungsverfahren für getaggte Proteine aus E. coli221
9.6.1 Bakterienanzucht und Homogenisation222
9.6.2 Weitere Aufreinigung des heterologen Proteins224
10 Gelelektrophorese von Proteinen
10.1 Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)229
10.2 Die denaturierende SDS-PAGE229
10.2.1 Herstellung eines Proteinextrakts für die SDS-Gelelektrophorese229
10.2.2 Herstellen des Gels232
10.2.3 Der Gellauf 235
10.3 Das Färben der Gele237
10.4 Weitere Elektrophoreseverfahren für Proteine239
10.4.1 Native PAGE239
10.4.2 Isoelektrische Fokussierung239
10.4.3 2-D-Gelelektrophorese239
10.5 Western Blotting 241
10.6 Massenspektrometrische Verfahren246
11 Immunbiochemische Methoden
11.1 Antikörper251
11.2 Prinzipien immunbiochemischer Verfahren254
11.2.1 Immunpräzipitation254
11.2.2 Trägerbasierte Immunfärbung256
11.2.3 Immobilisierung des Antigens257
11.2.4 Blocken überschüssiger Bindestellen257
11.2.5 Detektion der Bindung257
11.2.6 Antikörper-Kaskaden259
11.2.7 Spezifische und unspezifische Bindungen260
11.3 ELISA261
11.3.1 Sandwich-ELISA263
11.3.2 Kompetitiver ELISA265
11.4 Immunfärbung nach Western Blot266
11.5 Immunaffinitätschromatographie269
11.6 Weitere Antikörperbasierte Methoden270
11.6.1 Rekombinante Antikörper270
11.6.2 Phage Display und scFv271
11.6.3 Immunhistochemische Verfahren273
11.6.4 Markierung von Zellen274
12 Fortgeschrittene Verfahren
12.1 DNA-Sequenzierung .278
12.1.1 Sequenzierung nach Sanger278
12.1.2 Herstellen von Proben für die DNA-Sequenzierung280
12.2 Next Generation Sequenzierung281
12.3 Von den „Omics“ zur Systembiologie285
12.4 Analyse der Genfunktion286
12.4.1 Reverse Genetik und Gene Targeting286
12.4.2 RNAi287
12.4.3 Durchführung von siRNA-Experimenten288
12.5 Genom Editierung289
13 Bioinformatik
13.1 Datenbanken296
13.2 Dateiformate298
13.3 Sequenzsuche anhand von Stichwörtern (Entrez)300
13.4 Sequenzsuche mit einer Sequenz (BLAST)300
13.5 Bioinformatik zur Planung der Laborarbeit305
14 Anhang
A1 Sicherheit im Labor308
A2 Die 10 goldenen Laborregeln309
A3 Das Laborbuch und die finale Arbeit311
Verzeichnis der „Gut zu wissen“-Boxen313
Abbildungsverzeichnis314
Verzeichnis der Maps316
Verzeichnis der Protokolle316
Tabellenverzeichnis317
Abkürzungsverzeichnis318
Sachverzeichnis321
Quellenverzeichnis 328