Zytologische und molekulare Studien zum Resistenzlocus Rpv12 gegen den Falschen Mehltau der Rebe (Plasmopara viticola)

Plasmopara viticola, das Phytopathogen welches den Falschen Mehltau der Rebe verursacht, kann zu erheblichen Ernteverlusten im Weinbau führen, weshalb zur Vorbeugung eines Befalls große Mengen von Spritzmitteln ausgebracht werden müssen. Um diese Umwelt- und Finanzbelastung zu reduzieren, ist die Identifikation von Resistenz-vermittelnden genomischen Sequenzen essenziell, um die gezielte Züchtung widerstandsfähiger Rebsorten zu verbessern. Bis heute konnten über zwanzig solcher Resistenzloci allein für P. viticola identifiziert werden, ihre detaillierte Funktion und das assoziierte Resistenz-vermittelnde Gen wurden bis heute aber nur selten aufgeklärt. Im Rahmen der durchgeführten Arbeiten konnte die mikroskopische Darstellung der Infektion von P. viticola in Rpv12-tragenden Genotypen detailliert dokumentiert werden. Hierfür wurden die Genotypen `Afus Ali´ und `Italia´ als anfällige Referenzsorten verwendet, `Kunbarat´ (Rpv12, Rcg1) und `Kunleany´ (Rpv12) als ursprüngliche Rückkreuzungen der Rpv12-tragenden Vitis amurensis, wurden im Vergleich zu Genotypen die im Rpv12-Locus homozygot sind, analysiert. Ergänzend wurden die Genotypen 65-153-18 (Rpv12, Rcg1), 2004-043-0021 (Rpv1/Run1, Rpv3.1, Ren3, Ren9) und 2014-099-0003 (Rpv12, Rcg1, Ren3, Ren9) mitgeführt. Die Verwandtschaft der Genotypen wurde mittels SSR-Marker-Analyse überprüft. Dabei zeigte sich, dass `Kunbarat´, der bisher als Kreuzungsprodukt aus `Italia´ und 28/19 geführt wurde, eigentlich ein Kreuzungsprodukt aus `Afus Ali´ und 28/19 ist und somit Vollgeschwister mit `Kunleany´ ist. Auch konnte eine Fehlannahme in der Nachkommenschaft von `Kunbarat´ geklärt werden. `Petra´ ist Nachkomme von `Savagnin blanc´ und nicht `Pinot Noir´. Mittels unterschiedlicher Färbemethoden für die Mikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei der Rpv12-vermittelnden Resistenz um eine Post-Penetrations-Resistenz handelt. Diese basiert vor allem auf einer schnellen hypersensitiven Reaktion unter Freisetzung von H2O2. Dies zeigt sich durch eine übermäßige Ausprägung von Haustorien von P. viticola in resistenten Genotypen aber auch durch eine nahezu vollständige Inhibierung des Myzelwachstums bei Genotypen, die im Rpv12-Locus homozygot sind. Eine Kallose- oder anderweitige Zellwandverstärkung auf mikroskopischer Ebene konnte nicht dokumentiert werden. Es konnte jedoch eine Verstärkung der Resistenz durch Homozygotie im Rpv12-Locus beobachtet werden. Auch ließ sich ein additiver Effekt bei den homozygoten Genotypen Hozy01 (Rpv12 homozygot), Hozy10 (Rpv3.1 und Rpv12 homozygot) nachweisen. Durch eine Kooperation mit dem Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation konnten verschiedene CAPS-Marker auf über zweihundert Rpv12-tragenden Genotypen getestet werden, wovon einer als potenziell Resistenz-assoziiert bewertet werden kann.
Im Rahmen einer weiteren Kooperation mit dem Centrum für Biotechnologie (CeBiTec) der Universität Bielefeld und dem Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung, Genomzentrum Köln der Max-Planck-Gesellschaft, wurde unter Nutzung von Trio Binning ein nach Haplotypen differenziertes de novo-Assembly des Genotyps 2014-099-0003 (Rpv12, Rcg1, Ren3, Ren9) durchgeführt. Dadurch konnte der Rpv12-Locus, der durch Venuti et al. (2013) identifiziert wurde, zwischen den SSR-Markern UDV-350 und UDV-370 um etwa 366 kb reduziert werden. Die Anzahl potenzieller Resistenzgene auf Basis von NLR-Motiven wurde dadurch von zwölf (PN40024) auf vier reduziert. Durch RNA-Seq eines nicht-inokulierten Blattes gelang es auf zwei der vier Kandidatengene je zwei Transkripte mit getrennter Teilfunktion der NLRs zu identifizieren, was zur Hypothese des differenziellen Splicings führte.
Auf Grundlage der nun zur Verfügung stehenden Sequenzen wurden neue SSR-Marker zur Identifikation des Rpv12-Locus entwickelt. Einen zusätzlichen Aspekt dieser Arbeit stellte die Entdeckung eines neuen möglichen Resistenzlocus-Trägers dar. Eine Kreuzung aus V. riparia und V. rupestris zeigte sich äußerst widerstandsfähig gegenüber P. viticola. Erste mikroskopische und molekularbiologische Studien zum Ausschluss möglicher bekannter Resistenzloci wurden durchgeführt und im Abgleich mit den entsprechenden Locus-assoziierten Referenzsorten keine Übereinstimmungen gefunden. Plasmopara viticola, causing downy mildew in grapevine, is responsible for considerable yield loss in viticulture. The reason why large amounts of fungicides are needed to prevent infestation. To reduce this environmental and financial burden, the identification of resistance-mediating genomic sequences, which enable the targeted breeding of resistant species, is essential. To date, more than twenty resistance loci have been identified against P. viticola, but their detailed function and the associated resistance-mediating gene have rarely been elucidated. We documented P. viticola infection in Rpv12-carrying genotypes in detail by microscopic imaging. For this purpose, the genotypes `Afus Ali´ and `Italia´ were used as susceptible reference cultivars, `Kunbarat´ (Rpv12, Rcg1) and `Kunleany´ (Rpv12) as original backcrosses of Rpv12-carrying Vitis amurensis, were analysed in comparison to genotypes homozygous in the Rpv12 locus. We included supplemental genotypes 65-153-18 (Rpv12, Rcg1), 2004-043-0021 (Rpv1/Run1, Rpv3.1, Ren3, Ren9), and 2014-099-0003 (Rpv12, Rcg1, Ren3, Ren9). We verified the lineage of these genotypes by SSR-Marker analysis. `Kunbarat´ was previously listed as a cross product of `Italia´ and 28/19. However, our analysis showed that it actually is a cross product of `Afus Ali´ and 28/19 and is therefore a full sibling of `Kunleany´. Another misconception in the progeny of `Kunbarat´ could be clarified: `Petra´ is a descendant of `Savagnin blanc´ and not `Pinot Noir´. Using different staining methods for microscopy, we showed that the Rpv12-mediated resistance is a post-penetration resistance. Primarily, this is based on a rapid hypersensitive response upon release of H2O2. This was confirmed by excessive expression of haustoria of P. viticola in resistant genotypes but also by almost complete inhibition of mycelial growth in genotypes homozygous in the Rpv12 locus. No callose or other cell wall enhancement could be documented as Rpv12-related at the microscopic level. We documented an enhancement of resistance by homozygosity in the Rpv12 locus. Furthermore, we demonstrated an additive effect in the homozygous genotypes Hozy01 (Rpv12 homozygous), Hozy10 (Rpv3.1 and Rpv12 homozygous). As part of a collaboration with the Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation, we tested various CAPS markers for over two hundred Rpv12-carrying genotypes, of which one can be evaluated as putative resistance-associated.
In another collaboration with the Center for Biotechnology (CeBiTec) of Bielefeld University and the Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Genome Center Cologne of the Max Planck Society, a de novo assembly of genotype 2014-099-0003 (Rpv12, Rcg1, Ren3, Ren9) differentiated by haplotype could be performed using trio binning. This reduced the Rpv12 locus identified by Venuti et al. (2013) between SSR markers UDV-350 and UDV-370 by approximately 366 kb. As well as the number of potential resistance genes based on NLR motifs was reduced from twelve (PN40024) to four. RNA-Seq of a non-inoculated leaf identified two transcripts each with separate partial function of NLRs on two of the four candidate genes, which lead to the hypothesis of differential splicing. Based on this sequences, new SSR markers were developed to identify the Rpv12 locus.
An additional aspect of this work was the discovery of a new potential resistance locus carrier. A crossbreed between V. riparia and V. rupestris proved to be highly resistant to P. viticola. Initial microscopic and molecular biological studies to exclude possible known resistance loci showed no matches with the corresponding locus-associated reference cultivars.