Studien zum Resistenzlokus Rpv10 gegen den Falschen Mehltau (Plasmopara viticola) der Weinrebe (Vitis vinifera)

Durch vorangegangen Studien entstanden weiterführende Fragestellungen an dem ursprünglich
die aus der asiatischen Wildspezies Vitis amurensis stammenden Resistenzlokus (Rpv10-Lokus) bearbeitet wurden. Die Sequenzierung der beiden Haplotypen des Rpv10-Lokus der Sorte ’Solaris’ ergab eine Auswahl von Kandidatengenen. Diese wurden zunächst bioinformatisch charakterisiert, im Anschluss durch spezifische Primer erfolgreich amplifiziert und in anfällige Reben in vitro transformiert.
Durch mikroskopische Studien an Rpv10-Trägern und verschiedenen Vergleichssorten (ein anfälliger Genotyp, ein Rpv3.3-Träger und Genotypen mit Rpv10/Rpv3.3) wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach experimenteller Inokulation wichtige Informationen zum Resistenzmechanismus erarbeitet. Hier zeigen sich nach sieben Tag post Inokulation deutliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen. Diese sind zu diesem Zeitpunkt bereits makroskopisch zu erkennen. Mikroskopische Unterschiede zeigen sich bereits nach vier Tagen am Wachstum des Mycels innerhalb des Mesophylls. Für die objektive Bewertung der mikroskopischen Aufnahmen nach sieben Tagen wurde die Software WinRhizo genutzt, um die Fläche des Myzels im Mesophyll zu berechnen.
Durch RNA-Seq-Studien an einem homozygoten (Rpv10/Rpv10), einem heterozygoten (Rpv10/Rpv3.3) und anfälligen Referenzgenotypen konnten neue Erkenntnisse gewonnen werden. Hier wurde die Anzahl der induzierten Gene in den verschiedenen Genotypen ausgewertet und nach, für die Pathogen-Pflanze-Interaktion wichtigen, GO-Termen eingeteilt. Erwartungsgemäß wurde die höchste Anzahl an induzierten Genen in dem heterozygoten Genotypen nachgewiesen. Der anfällige Genotyp bildet in allen durchgeführten Analysen das Schlusslicht. Weiterhin konnten auf Chromosom 16 zwei wichtige Gen-Cluster für die Wirt-Pathogen-Interaktion beschrieben werden. Bei dem ersten Gen-Cluster handelt es sich um ein PAL-Cluster (15 Gene) dessen Genprodukte dafür bekannt sind, bei Beschädigung der Pflanzenzellen Sekundärmetabolite zu induzieren. Das zweite ist ein STS-Cluster (35 Gene). Die darin befindlichen Gene führen zur
Synthese von Sekundärmetaboliten, genauer zu den Phytoalexinen. Sie werden in vielen Literaturquellen als Abwehrstoffe gegen Bakterien, Pilze, Viren und Insekten beschrieben. In diesem STS-Cluster konnte gezeigt werden, dass bei Inokulation im heterozygoten Genotypen 27 STSGene stark hochreguliert werden. Im anfälligen Genotypen wurden dagegen nur sieben Gene hochreguliert.
Für die Validierung der RNA-Seq-Analyse wurde eine qRT-PCR an ausgewählten Genen für Transkriptionsfaktoren so wie eine Stilben-Analyse zu bestimmten Zeitpunkten (0 hpi, 24 hpi, 48 hpi und 72 hpi) durchgeführt. Für die qRT-PCR wurden drei verschiedene Genotypen (’Solaris’, ’Sibera’ und ’Müller-Thurgau’) verwendet. Die Stilben-Analysen wurden mit den identischen Genotypen wie die durch Mikroskopie untersucht ausgewählt. Beide Validierungsmethoden bestätigen
die Ergebnisse der RNA-Seq-Analyse. Previous studies promoted molecular and histological investigations on the resistance locus Rpv10 originating from the Asian wild species Vitis amurensis. By sequencing the two haplotypes of the Rpv10 locus of the cultivar ’Solaris’ some candidate genes were characterized by bioinformatic tools, isolated by amplification with specific primers and transformed into susceptible grapevines grown in vitro (Dudenhöffer and Zyprian, unpubliziert).
Microscopic studies on a Rpv10 carrying cultivar and different reference varieties (a susceptible genotype, Rpv3.3 carriers and genotypes with Rpv10/Rpv3.3) provided important information on the resistance mechanism at different time points after inoculation. At seven days post-inoculation strong differences between the different genotypes became obvious. These can already be recognized macroscopically at this time. Microscopic differences appear already after four days at the growth of the mycelium within the mesophyll. For objective evaluation of the microscopic images after seven days, the software WinRhizo was used to calculate the area of mycelium growth within the mesophyll.
RNA-Seq studies on a homozygous (Rpv10/Rpv10), a heterozygous (Rpv10/Rpv3.3) and susceptible reference genotypes provided useful insights. The number of induced genes in the different genotypes was evaluated and classified according to GO terms that are important for pathogenplant interaction. As expected, the highest number of induced genes could be detected in the heterozygous genotype. The susceptible genotype is the taillight in all analyses performed. Furthermore,
two important gene clusters for the different genotypes could be described on chromosome 16. The first gene cluster is a PAL cluster (15 genes) which is known to code for the entry of metabolic pathways leading to secondary metabolites when plant cells are damaged.The second gene cluster is an STS cluster (35 genes). The genes in this cluster encodes for
enzymes producing secondary metabolites, more precisely phytoalexins. These are activated by PAL. They are described in many literature sources as defensive substances against bacteria, fungi, viruses and insects. In this STS cluster it could be shown that 27 STS genes are strongly upregulated in the heterozygous genotype. In the susceptible genotype, however, only seven genes were upregulated.
For the validation of the RNA-Seq analysis, qRT-PCR was performed on selected genes encoding transcription factors. In addition the amount of stilbenes was analysed at certain times (0 hpi, 24 hpi, 48 hpi and 72 hpi). Three different genotypes (’Solaris’, ’Sibera’ and ’Müller-Thurgau’) were used for qRT-PCR. The stilbene analyses were performed with identical genotypes as selected for microscopy. Both validation methods confirm the results of the RNA-Seq analysis.