Romeis - Mikroskopische Technik (eBook)

Herausgegeben von:Priv. Doz. Dr. Maria Mulisch, geb. 1952 in Braunschweig/Niedersachsen. 1973-1974 Studium der Philosophie in Heidelberg; 1974-1980 Studium der Biologie in Heidelberg; 1983 Promotion; 1993 Habilitation. Forschungsschwerpunkt: Protozoologie. Seit 2001 Wissenschaftliche Leiterin der Zentralen Mikroskopie im Biologiezentrum der CAU Kiel. Arbeitsschwerpunkte: Licht- und elektronenmikroskopische Präparationen Immunlokalisationen und Analysen an biologischen Proben, Duchführung von Lehrveranstaltungen für Studenten und Anwender in den Bereichen Licht- und Elektronenmikroskopie.Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. Ulrich Welsch, geb. 1940 in Neustadt/Holstein. 1960-1966 Studium der Anglistik und Biologie in München und Kiel; 1974-1981Studium der Humanmedizin in Kiel; 1983 Approbation. 1984 Vorstand des Lehrstuhls 2 (Cytologie, Histologie, Mikroskopische Anatomie) an der Anatomischen Anstalt der LMU München. Etwa 350 Originalarbeiten u.a. zu den Themen: Vergleichende Mikroskopische Anatomie der Deuterostomier, mutabiles Bindegewebe, Morphologie der Gymnophionen, Zellbiologie der Milch und der Milchdrüse, apokrine Sekretion in Duftdrüsen der Säugetiere.Mit Beiträgen von:Dr. Erna Aescht ( Oberösterreichisches Landesmuseum, Biologiezentrum, Linz-Dornach )Frau Simone Buechl ( Akademie für medizinische Berufe, MTLA Schule, Ulm-Wiblingen )Frau Anja Burmester ( Kiel )Prof. Dr. Christine Desel ( Botanisches Institut und Botanischer Garten, Christian-Albrechts-Universität Kiel )Dr. Christoph Hamers ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )Dr. Guido Jach ( Phytowelt Greentechnologies GmbH, Köln )Dr. Manfred Kässens ( Olympus Soft Imaging Solutions, Münster ) Priv. Doz. Dr. Barbara E. Nixdorf-Bergweiler (Institut für Physiologie, Christian-Albrechts-Universität Kiel )Herr Stefan Pfeiffer ( Microscopy Services Dähnhardt, Flintbek )Herr Detlef Pütz ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )Herr Bernd Riedelsheimer ( Anatomische Anstalt der Universität München)Dr. Frank van den Boom ( Nikon GmbH Geschäftsbereich Mikroskope, Düsseldorf )Dr. Rainer Wegerhoff ( Olympus Life and Material Science Europa GmbH, Hamburg )

Title Page 3
Copyright Page 4
Autoren 5
Benno Romeis (1888 - 1971) 7
Vorwort der Herausgeber 8
Table of Contents 10
1 Mikroskopische Verfahren 12
1.1 Lichtmikroskopie 12
1.1.1 Die Geschichte des Mikroskops 12
1.1.2 Einführung in die Physik des Lichtes 13
1.1.2.1 Licht 14
1.1.2.2 Brechung, Beugung, Interferenz und Polarisation 14
1.1.2.3 Brechung und Brechungsindex 15
1.1.2.4 Beugung und Interferenz 15
1.1.2.5 Polarisation 15
1.1.3 Die Hauptkomponenten des Mikroskops 15
1.1.4 Wie entsteht die Vergrößerung 17
1.1.5 Die Objektive 18
1.1.5.1 Korrektur der chromatischen Aberration und der Bildwölbung 18
1.1.5.2 Auflösung, Schärfentiefe, Arbeitsabstand 19
1.1.6 Kondensoren für die Durchlichtmikroskopie 21
1.1.7 Grundsätzliche Einstellungen für die Mikroskopie 21
1.1.8 Die Köhlersche Beleuchtung 21
1.1.9 Kontrastmethoden 22
1.1.9.1 Dunkelfeld 22
1.1.9.2 Phasenkontrast 24
1.1.10 Relieferzeugende Kontrastmethoden 26
1.1.10.1 Schrägbeleuchtung 26
1.1.10.2 Modulationskontrast 26
1.1.10.3 Differenzieller Interferenzkontrast (DIC) 27
1.1.11 Stereomikroskopie 29
1.1.12 Fluoreszenzmikroskopie 31
1.1.12.1 Prinzip der Fluoreszenz 31
1.1.12.2 Hauptkomponenten im Fluoreszenzmikroskop 31
1.1.13 Konfokale Mikroskopie 33
1.1.14 Multiphotonenmikroskopie 35
1.1.15 TIRF 35
1.1.16 Luminiszenzmikroskopie 36
1.2 Elektronenmikroskopie 36
1.2.1 Einleitung 36
1.2.1.1 Die Anfänge der Elektronenmikroskopie 36
1.2.1.2 Das Auflösungsvermögen in der Elektronenmikroskopie 37
1.2.2 Transmissionselektronenmikroskopie 37
1.2.2.1 Elektronenstrahlquelle 38
1.2.2.2 Elektromagnetische Linsen 40
1.2.2.3 Strahl-Probe-Wechselwirkungen 40
1.2.2.4 Kontrastarten 41
1.2.2.5 Beobachtung und Aufzeichnung des Bildes 43
1.2.2.6 Probenpräparation 43
1.2.2.7 Analysemethoden 43
1.2.3 Elektronentomografie 43
1.2.4 EFTEM 44
1.2.5 REM und ESEM 45
1.2.5.1 Grundsätzlicher Aufbau und Funktionsweise 45
1.2.5.2 Wechselwirkungen zwischen Elektronenstrahl und Präparat 46
1.2.5.3 Detektion 47
1.2.5.4 Vergrößerung und Auflösungsvermögen 48
1.2.5.5 Anwendungen und Probenpräparation 48
1.2.5.6 ESEM – Rasterelektronenmikroskopie unter Umgebungsbedingungen 48
1.2.6 Rastersondenmikroskopie 49
1.2.6.1 Rastertunnelmikroskopie 49
1.2.6.2 Rasterkraftmikroskopie 49
2 Präparationsmethoden 50
2.1 Mikroskopische Untersuchungen von nativem Material 50
2.1.1 Arbeiten mit Lebendmaterial 50
2.1.1.1 Voraussetzungen für das Arbeiten mit Lebendpräparaten 50
2.1.1.2 Präparationsbeispiele für die Herstellung von Lebendpräparaten 51
2.1.1.2.1 Kulturen, Mikroorganismen und Kleinstlebewesen 51
2.1.1.2.2 Micro-Life-Objektträger für die Untersuchung aquatischer Kleinstlebewesen 51
2.1.1.2.3 Objektträger der Serie „? slide I “für die Beobachtung von Zellkulturen 52
2.1.1.2.4 Pflanzliche Präparate 52
2.1.1.2.5 Hirnschnittpräparate und Gewebekulturen 52
2.1.2 Durchführung von physiologischen Versuchen und Vitalfärbung 53
2.1.2.1 Einteilungen der Vitalfärbung 53
2.1.2.2 Eigenschaften von Vitalfarbstoffe 53
2.1.2.3 Vitalfarbstoffe für die Untersuchung in der Hellfeldmikroskopie 54
2.1.2.3.1 Trypanblau 54
2.1.2.3.2 Alizarin 55
2.1.2.3.3 Janusgrün 55
2.1.2.3.4 Neutralrot 55
2.1.2.4 Vitalfarbstoffe für die Untersuchung in der Fluoreszenzmikroskopie 56
2.1.2.4.1 Trypanblau 56
2.1.2.4.2 Acridinorange 56
2.1.2.4.3 Fluoresceindiacetat – Aufnahme von Tracern über die Plasmamembran 57
2.1.2.4.4 Zellkernfärbung am lebenden Präparat mit Hoechst und DRAQ5 58
2.1.2.4.5 Zellkernfärbung mit DAPI 59
2.1.3 Live-Cell-Imaging 59
2.1.3.1 Videofluoreszenzmikroskopie 60
2.1.3.1.1 Organellenmarker 60
2.1.3.2 Calcium-Imaging 61
2.1.3.3 Weitere Methoden des Live-Cell-Imaging (FLIM, FLIP, FRAP, FCS, TIRFM, FRET und BRET) 62
2.1.3.3.1 Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM 62
2.1.3.3.2 Fluorescence loss in photobleaching, FLIP und fluorescence recovery after photobleaching, FRAP 62
2.1.3.3.3 Fluorescence correlation spectroscopy, FCS 62
2.1.3.3.4 Total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM 63
2.1.3.3.5 Fluorescence resonance energy transfer, FRET 63
2.1.3.3.6 Bioluminescence resonance energy transfer, BRET 63
2.1.3.4 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 63
2.1.3.5 Multi-Spectral-Imaging (MSI) 64
2.1.4 Neuronale Tracer und ihre Anwendungen (Neuronales Tracing) 64
2.1.4.1 Retrograde und anterograde Tracer 65
2.1.4.1.1 Retrograde Tracer 65
2.1.4.1.2 Anterograde Tracer 67
2.1.4.1.3 Tracer, die sowohl anterograd als auch retrograd laufen 67
2.1.4.1.4 Lösen, Haltbarkeit und Lagerung der Tracersubstanzen 67
2.1.4.1.5 Auswahl des Tracers für ein Experiment 67
2.1.4.2 Allgemeiner Ablauf eines Versuchs 67
2.1.4.3 Techniken zur Tracer-Applikation 67
2.1.4.3.1 Kristalline Anwendung 68
2.1.4.3.2 Druckapplikation 68
2.1.4.3.3 Iontophoretische Injektion 69
2.1.4.4 Perfusionskammer für in vitro-Farbstoffapplikationen 71
2.1.4.5 Farbstoffapplikationen in der Interface-Kammer 73
2.1.4.6 Anwendungsbeispiele für Tracer-Applikationen 76
2.1.4.6.1 Fluoro Ruby (FR) 76
2.1.4.6.2 Biotinylierte Dextranamine (BDA) 79
2.1.4.6.3 Choleratoxin B (CtB) 81
2.1.4.6.4 Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin (PHA-L) 83
2.1.4.6.5 Neurobiotin, Biocytin 84
2.1.4.6.6 Carbocyanine (Lucifer Yellow, DiI, DiO, DiA) 87
2.2 Probengewinnung zur mikroskopischen Untersuchung und Präparation 88
2.2.1 Abstrichpräparate 88
2.2.2 Ausstrichpräparate 89
2.2.2.1 Ausstriche von Zellsuspensionen 89
2.2.2.2 Organausstriche 90
2.2.3 Tupf- oder Abklatschpräparate 90
2.2.4 Isolationspräparate (Zupfpräparate) 90
2.2.5 Isolation von Zellen 90
2.2.5.1 Entnahme von adhärenten Zellenaus Zellkulturen 90
2.2.5.2 Anreicherung von Suspensionszellen 91
2.2.5.3 Zellsuspensionen von Epithelien 91
2.2.5.4 Mazerationsmethoden von Zellverbänden 92
2.2.6 Isolation von Gewebeteilen 92
2.2.6.1 Biopsie 93
2.2.6.2 Native Schnitte 93
2.2.6.2.1 Freihandschnitte 93
2.2.6.2.2 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Handmikrotoms 93
2.2.6.2.3 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Vibratoms 94
2.2.6.2.4 Herstellung von Schnitten mit Hilfe des Kryostaten 95
2.2.7 Isolation von Zellkompartimenten und Organellen 95
2.2.8 Trennen und Sortieren von Zellen 95
2.2.8.1 Durchflusscytometrie 95
2.2.8.2 Zelltrennung mit Hilfe paramagnetischer Kügelchen (beads) 96
2.2.9 Lasermikrodissektion 96
2.3 Fixierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 98
2.3.1 Theorie der Fixierung 98
2.3.1.1 Ziel der Fixierung 98
2.3.1.2 Fixierungsverfahren 99
2.3.1.3 Mechanismen der chemischen Fixierung 100
2.3.2 Fixanzien für die Licht- und Elektronenmikroskopie 100
2.3.2.1 Fixanzien für die Histologie 100
2.3.2.1.1 Formalin und formalinhaltige Lösungen 102
2.3.2.1.2 Ethanol und ethanolhaltige Lösungen 102
2.3.2.1.3 Fixierung in kalten Lösungsmitteln 103
2.3.2.1.4 Pikrinsäure und pikrinsäurehaltige Lösungen 103
2.3.2.1.5 Quecksilberchlorid (Sublimat) und sublimathaltige Lösungen 103
2.3.2.1.6 Die HOPE-Fixierung 103
2.3.2.2 Gängige Fixanzien für die Elektronenmikroskopie 107
2.3.2.2.1 Glutaraldehyd (GA) 107
2.3.2.2.2 Formaldehyd (FA) 109
2.3.2.2.3 Fixierungsgemische mit Glutaraldehyd und Formaldehyd 109
2.3.2.2.4 Osmiumtetroxid 109
2.3.2.3 Spezielle Fixierungen 110
2.3.2.3.1 2-Phasen-Fixierung 110
2.3.2.2.2 Alternative Fixanzien für die Immunmarkierung und Enzymlokalisation 110
2.3.3 Fixierungsbedingungen und Anforderungen an die Präparate 110
2.3.3.1 Präparatgröße und Penetration 110
2.3.3.2 Menge und Konzentration des Fixans 110
2.3.3.3 Dauer und Temperatur der Fixierung 110
2.3.3.4 Osmolarität und Ionenzusammensetzung 110
2.3.3.5 pH, Puffer und Pufferzusätze 111
2.3.4 Praxis der Fixierung für die Lichtmikroskopie 111
2.3.4.1 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten 112
2.3.5 Praxis der Fixierung für die Elektronenmikroskopie 112
2.3.6 Fixierungsartefakte und Abhilfemöglichkeiten 113
2.3.7 Beispielhafte Anleitungen 114
2.3.7.1 Behandlung von Zellen und Suspensionen 114
2.3.7.2 Fixierungen für die Cytodiagnostik 114
2.3.7.2.1 Trockenfixierung 114
2.3.7.2.2 Feuchtfixierung 114
2.3.7.2.3 Hitzefixierung (Fixierung vonBakterien) 115
2.3.7.3 Fixierungen für die Elektronenmikroskopie 115
2.3.7.3.1 Fixierungen von menschlichen oder tierischen Gewebeproben 115
2.3.7.3.2 Fixierung von Pflanzenmaterial 115
2.3.7.3.3 Fixierung von Meerwasserorganismen 115
2.3.8 Aufbewahrung fixierten Materials 115
2.3.9 Fixierungs- und Einbettautomaten 115
2.4 Schnittpräparation 116
2.4.1 Schnittpräparation für die Lichtmikroskopie 116
2.4.1.1 Einbettung 116
2.4.1.1.1 Allgemeines 116
2.4.1.1.2 Auswaschen des Fixierungsmittels aus den Präparaten 116
2.4.1.1.3 Entwässern der Präparate 117
2.4.1.1.4 Einbringen der Präparate in ein Intermedium (Zwischenflüssigkeit) 119
2.4.1.1.5 Durchtränken der Präparate mit dem Einbettmittel 119
2.4.1.1.6 Ausgießen (in Blöcke gießen) der Präparate im Einbettmittel 119
2.4.1.1.7 Aushärten der Blöcke 121
2.4.1.2 Einbettzubehör 121
2.4.1.2.1 Zubehör für die Einbettung von Hand 121
2.4.1.2.2 Einbettautomaten 121
2.4.1.2.3 Paraffinspender/Ausgießstation 122
2.4.1.3 Einbettprotokolle 122
2.4.1.3.1 Paraffineinbettung 122
2.4.1.3.2 Kunststoffeinbettung 126
2.4.1.3.3 Celloidineinbettung 128
2.4.1.3.4 Einbettung in Celloidin-Paraffin 131
2.4.1.3.5 Agareinbettung 131
2.4.1.4 Mikrotome und Mikrotomie 131
2.4.1.4.1 Allgemein 131
2.4.1.4.2 Messer in der Paraffinmikrotomie 132
2.4.1.4.3 Spezialmesser 133
2.4.1.4.4 Stellung des Mikrotommessers beim Paraffinschneiden 133
2.4.1.4.5 Mikrotomtypen 134
2.4.1.4.6 Schneidetechnik am Mikrotom 135
2.4.1.5 Leitfaden zur Beurteilung der Präparation 136
2.4.1.5.1 Probleme und Artefakte bei der Schnittpräparation und ihre Abhilfe 136
2.4.1.5.2 Beurteilung von Artefakten im Präparat 136
2.4.2 Schnittpräparation für die Elektronenmikroskopie 138
2.4.2.1 Entwässern und Einbetten für die Ultradünnschnitttechnik 138
2.4.2.1.1 Waschen 138
2.4.2.1.2 Entwässerung 138
2.4.2.1.3 Einbettung von Gewebeproben 139
2.4.2.1.4 Einbettung von Suspensionszellen, kleinen Gewebeteilen oder -schnitten 142
2.4.2.1.5 Einbettung und Schnittvorbereitung von Aufwuchspräparaten 143
2.4.2.1.6 Orientierte Einbettung, Umbettung und Umorientierung von Präparaten 143
2.4.2.1.7 Umbettung von Paraffineinbettungen 145
2.4.2.1.8 Häufige Probleme durch Fehler bei der Entwässerung und Einbettung und mögliche Abhilfe 145
2.4.2.2 Ultramikrotomie 146
2.4.2.2.1 Objektträgernetzchen (Grids) 146
2.4.2.2.2 Glas- und Diamantmesser 148
2.4.2.2.3 Trimmen 148
2.4.2.2.4 Anfertigen und Auffangen der Schnitte 149
2.4.2.2.5 Probleme bei der Ultramikrotomie und Möglichkeiten der Abhilfe 152
2.5 Präparation für die konventionelle Rasterelektronenmikroskopie (REM) 154
2.5.1 Präparate für die REM 154
2.5.2 Präparationsschritte 154
2.5.2.1 Reinigung 154
2.5.2.2 Freilegen interner Strukturen 155
2.5.2.3 Stabilisierungen 155
2.5.2.4 Abdruckverfahren 156
2.5.2.5 Trocknung 156
2.5.2.5.1 Imprägnierung mit Glycerin 156
2.5.2.5.2 Lufttrocknung 156
2.5.2.5.3 Gefriertrocknung 156
2.5.2.5.4 Kritische-Punkt-Trocknung 156
2.5.2.6 Befestigen der Präparate 157
2.5.2.7 Sputtern 158
2.5.2.7.1 Prinzip des Sputterns 158
2.5.2.7.2 Sputter-Coater 158
2.5.2.7.3 Wahl des Target-Materials 158
2.5.2.7.4 Schichtdicken 159
2.5.2.8 Techniken für stark zerklüftete Objekte oder hohe Auflösung 159
2.5.2.8.1 Imprägnierung mit OsO4 159
2.5.2.8.2 Abdecken mit Aluminiumfolie 159
2.5.2.9 Aufbewahrung der Präparate 159
2.5.3 Artefakte 159
2.6 Kontrastierungstechniken für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 160
2.6.1 Einführung 160
2.6.2 Negativkontrastierung 160
2.6.2.1 Kontrastierungslösungen 160
2.6.2.1.1 Phosphorwolframat (PW) 160
2.6.2.1.2 Uranylacetat (UA) 161
2.6.2.2 Vorgehensweise 161
2.6.2.2.1 1-Schritt-Methode 161
2.6.2.2.2 2-Schritt-Methode 161
2.6.2.3 Probleme und Problemlösungen 162
2.6.3 Bedampfung 163
2.6.4 Positive Kontrastierungstechniken 163
2.6.4.1 Generelle Kontrastierungen 164
2.6.4.1.1 en bloc-Kontrastierung 164
2.6.4.1.2 Schnittkontrastierung 164
2.6.4.1.3 Schnittkontamination durch die Kontrastierung und mögliche Abhilfen 165
2.6.4.2 Spezifische Nachweise 165
2.6.4.2.1 Nachweis von Ionen 165
2.6.4.2.2 Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) 166
2.6.4.2.3 Nachweis von Zuckern 166
2.7 Kryopräparation für die Licht- und Elektronenmikroskopie 168
2.7.1 Kryopräparationstechniken für die Lichtmikroskopie 168
2.7.1.1 Einfrieren der Probe 168
2.7.1.1.1 Einfrieren mit Isopentan 169
2.7.1.1.2 Einfrieren mit CO2 169
2.7.1.1.3 Aufkleben und langsames Einfrieren 169
2.7.1.2 Kryostatschnitte 170
2.7.1.2.1 Herstellen von Kryostatschnitten 170
2.7.2 Kryopräparationen für die Elektronenmikroskopie 171
2.7.2.1 Kryofixierung 171
2.7.2.1.1 Einfrieren bei Umgebungsdruck 172
2.7.2.1.2 Einfrieren unter hohem Druck (Hochdruckgefrierfixierung) 174
2.7.2.2 Entwässerung bei tiefen Temperaturen 178
2.7.2.2.1 Entwässerung bei 0–4 °C 178
2.7.2.2.2 Progressive lowering of temperature-(PLT-)Entwässerung 179
2.7.2.2.3 Gefriersubstitution 179
2.7.2.3 Gefrierbruch- und Replikatechnik 180
2.7.2.3.1 Vorbereitung der Gefrierbrucheinrichtung 180
2.7.2.3.2 Transfer der Probe in die Gefrierbruchanlage 182
2.7.2.3.3 Gefrierbruch 182
2.7.2.3.4 Gefrierätzung 183
2.7.2.3.5 Replizieren der Bruchoberfläche 183
2.7.2.3.6 Abschwimmen der Replika und Replikareinigung 184
2.7.2.4 Kryoschneiden 184
2.7.2.4.1 Kryoschneiden von gefriergeschützten Proben 185
2.7.2.4.2 Kryoschneiden von nicht gefriergeschützten Proben 185
2.8 Literatur 185
3 Färbungen 191
3.1 Allgemeines zur Färbung 191
3.2 Farbstoffe 191
3.2.1 Der sichtbare Anteil des Spektrums, Farben und Licht siehe Kapitel 1.1.2 191
3.2.2 Klassifizierung von Farbstoffen 191
3.2.3 Wichtige Farbstoffe 192
3.2.4 Ladung der Farbstoffe 192
3.2.5 Kennzeichnung von Farbstoffen 194
3.2.6 Färbevokabular 194
3.2.7 Färbetheorien 195
3.2.7.1 Chemische Färbungen 196
3.2.7.2 Physikalische Färbungen 196
3.2.7.3 Physiko-chemische Färbungen 196
3.2.7.4 Theorie der indirekten Färbungen (Beizen) 196
3.3 Herstellen der Farblösungen 197
3.4 Färbezubehör 197
3.4.1 Färbeküvetten 197
3.4.2 Färbebänke, Tropfflaschen und sonstiges Zubehör 197
3.4.3 Färbeautomaten 198
3.4.3.1 Färbeautomat „Karussell“ 198
3.4.3.2 Linearfärbeautomat 198
3.4.3.3 programmierbarer Universalfärbeautomat 198
3.5 Behandlung der Schnitte vor und nach dem Färben 199
3.5.1 Montage der Schnitte auf Objektträger und Trocknung 199
3.5.1.1 Objektträger 199
3.5.1.2 Schnittmontage und Trocknung 199
3.5.1.3 Beschichtungsmöglichkeiten der Objektträger 200
3.5.1.3.1 Eiweißglycerin 200
3.5.1.3.2 Chromalaungelatine 200
3.5.1.3.3 Poly-L-Lysin 200
3.5.1.3.4 Silanisierung 201
3.5.2 Behandlung der Schnitte unmittelbar vor der Färbung 201
3.5.2.1 Paraffinschnitte 201
3.5.2.2 Gefrierschnitte 201
3.5.2.3 Kunststoffschnitte 201
3.5.2.4 Fixierungsniederschläge und deren Entfernung 202
3.5.3 Behandlung der Schnitte nach der Färbung 203
3.5.3.1 Nachbehandlung und Fixieren der Färbung 203
3.5.3.2 Einschließen der Präparate 203
3.5.3.2.1 Einschlussmittel für wasserfreie Präparate 204
3.5.3.2.2 Einschlussmittel für wasserhaltige Präparate 205
3.5.3.2.3 Umranden der Präparate 207
3.5.3.3 Erneutes Eindecken/Reparatur 207
3.5.3.4 Behandlung verblasster Präparate 207
3.6 Färbemethoden 208
3.6.1 Kernfarbstoffe und Kernfärbungen 209
3.6.1.1 Hämatoxylin 209
3.6.1.1.1 Hämatoxylin und Hämatein 209
3.6.1.2 Hämatoxylinlacke 209
3.6.1.3 Hämalaune 209
3.6.1.3.1 Saures Hämalaun n. Mayer (1920) 210
3.6.1.3.2 Hämalaun n. Harris (1900) 211
3.6.1.3.3 Hämalaun n. Delafield (1885) 211
3.6.1.3.4 Saures Hämalaun n. Ehrlich (1886) 212
3.6.1.4 Färben mit Hämalaunlösungen 212
3.6.1.5 Eisenhämatoxyline 213
3.6.1.6 Weitere Kernfärbungen 214
3.6.2 Cytoplasmafarbstoffe und Cytoplasmafärbungen 215
3.6.3 Fluoreszenzfarbstoffe 217
3.6.3.1 Acridinorange 217
3.6.3.2 Coriphosphin O 217
3.6.3.3 Auramin-Rhodamin 217
3.6.4 Pigmente 217
3.6.4.1 Allgemeines 217
3.6.4.2 Löslichkeit der Pigmente in Säuren und Laugen 218
3.6.4.3 Bleichen der Pigmente mit H2O2 218
3.6.4.4 Nachweis/Verhalten einzelner Pigmente 219
3.6.4.4.1 Argentaffine Reaktion 219
3.6.4.4.2 Hämosiderin (Siderin) 220
3.6.4.4.3 Hämatoidin 220
3.6.4.4.4 Malariapigment 220
3.6.4.4.5 Lipofuszin (Chromolipoid) 220
3.6.4.4.6 Melanin 220
3.6.4.4.7 Exogene Pigmente 220
3.6.5 Basophilie 220
3.6.6 Metachromasie 221
3.6.7 Übersichtsfärbungen 223
3.6.8 Schnellfärbungen 225
3.6.9 Bindegewebsfärbungen 225
3.6.9.1 Trichromfärbungen 225
3.6.9.2 Darstellung von elastischen Bindegewebsfasern 229
3.6.9.2.1 Komponenten des elastischen Fasersystems 229
3.6.9.2.2 Färbung von Mikrofibrillen der elastischen Fasern und Oxytalanfasern 230
3.6.9.3 Darstellung von retikulären Bindegewebsfasern 233
3.6.10 Stoffnachweise 236
3.6.10.1 Kohlenhydrate 236
3.6.10.1.1 Alcianblaufärbungen 238
3.6.10.1.2 Enzymverdauung 240
3.6.10.1.3 Glykogen 241
3.6.10.1.4 Nachweis von Kohlenhydraten und Glykokonjugaten mit Hilfe von Lektinen 243
3.6.10.2 Amyloid 245
3.6.10.3 Fibrin 247
3.6.10.4 Lipide 247
3.6.10.5 Eisen 249
3.6.10.6 Calciumsalze (Kalk) 251
3.6.10.7 Proteine 252
3.6.11 Nachweis von DNA (Desoxyribonucleinsäure) 252
3.6.12 Darstellung von Bakterien, Pilzen, und Protozoen im histologischen Schnitt 253
3.6.13 Darstellung von Blutzellen im histologischen Schnitt 258
3.6.14 Darstellung des Nervengewebes 260
3.6.14.1 Färbung von Kern- und Nissl-Substanz 260
3.6.14.2 Darstellung von Nerven- und Gliazellen einschließlich ihrer Fortsätze 261
3.6.14.3 Darstellung von Neurofibrillen mit Silberimprägnationsverfahren 266
3.6.14.4 Darstellung der Markscheiden (Myelinscheiden) 270
3.6.14.5 Darstellung degenerierender markhaltiger Nervenfasern 274
3.6.14.6 Darstellung peripherer markhaltiger Nervenfasern 275
3.6.14.6.1 Osmierung 275
3.6.14.6.2 Darstellung der Axone peripherer Nerven 276
3.6.14.7 Darstellung von Gliazellen 276
3.6.14.8 Immunhistologische Nachweise des Nervengewebes 277
3.6.15 Färbungen an Kunststoffschnitten 277
3.6.15.1 Allgemeines 277
3.6.15.2 Entfernen des Kunststoffs (entplasten) aus dem Gewebeschnitt 278
3.6.15.3 Färben ohne Entfernen des Kunststoffs aus dem Schnitt 278
3.6.16 Stückfärbung 279
3.6.17 Medizinische Cytodiagnostik 280
3.6.17.1 Allgemeines und Zellentnahmeverfahren 280
3.6.17.2 Präparateherstellung 281
3.6.17.2.1 Abstrichpräparate von Schleimhäuten 281
3.6.17.2.2 Tupfpräparate 281
3.6.17.2.3 Organausstriche 281
3.6.17.2.4 Blutausstriche 281
3.6.17.2.5 Ausstriche von Flüssigkeiten oder Sekreten 282
3.6.17.2.6 Knochenmarkausstriche/ Quetschpräparate 282
3.6.17.2.7 Ausstriche von Feinnadelaspirationsmaterial 282
3.6.17.3 Fixierung 282
3.6.17.3.1 Trockenfixierung 283
3.6.17.3.2 Feuchtfixierung 283
3.6.17.3.3 Hitzefixierung (Fixierung vonBakterien) 283
3.6.17.4 Färbemethoden 283
3.6.17.4.1 Alternative Färbemethoden 286
3.7 Artefakte 291
3.8 Herstellen mikroskopischer Injektions- und Korrosionspräparate 292
3.8.1 Injektionspräparate 292
3.8.1.1 Tuscheinjektion 292
3.8.1.2 Gelatineinjektionen 292
3.8.1.3 Kautschukinjektion 294
3.8.2 Korrosionspräparate 294
3.9 Einsatz der Polarisationsmikroskopie für die medizinische Diagnostik 296
3.9.1 Grundlagen der Polarisationsmikroskopie 297
3.9.2 Topo-optische Reaktionen 298
3.9.2.1 Die Bedeutung der durch Kongorotfärbung verursachten Anisotropie in der Histologie 298
3.9.2.2 Metachromasie als inverse topo-optische Färbungsreaktion (Toluidinblau-Präzipitations-Methode nach Romhányi 1963) 299
3.9.2.3 Aldehyd-Bisulfit -Toluidinblau-(ABT)-Rektion, Permanganat-Toluidin-blau- (PBT)-Reaktion und Sialinsäurespezifische topo-optische Reaktion 301
3.10 Literatur 303
4 Präparationstechniken und Färbungen von speziellen Geweben 308
4.1 Präparation spezieller Gewebe 308
4.1.1 Paraffineinbettung von großen Objekten 308
4.1.2 Bearbeitung (Fixierung, Einbettung und z.T. Färbung) spezieller Organe 309
4.1.2.1 Zentralnervensystem 309
4.1.2.2 Sinnesorgane 310
4.1.2.2.3 Geruchrorgan 312
4.1.2.3 Respirationstrakt 312
4.1.2.4 Haut 313
4.1.2.4.1 Epidermis 313
4.1.2.4.2 Spezielle harte Differenzierungen der Epidermis 313
4.1.2.5 Geschlechtsorgane 314
4.1.2.5.1 Weibliche Geschlechtsorgane, Eizellen 314
4.1.2.5.2 Männliche Geschlechtsorgane, Spermien 314
4.1.2.6 Embryologische Präparate 316
4.1.2.6.1 Vögel 316
4.1.2.6.2 Säugetiere 317
4.1.2.6.3 Säugetiere: Präparieren jüngster Entwicklungsstadien 318
4.1.2.6.4 Säugetiere: Präparieren älterer Entwicklungsstadien 318
4.2 Präparation von Hartgewebe für die Histologie 318
4.2.1 Allgemeines 318
4.2.2 Präparationsmöglichkeiten 319
4.2.3 Fixierung von Hartgewebe 319
4.2.3.1 Allgemeines 319
4.2.3.2 Fixierflüssigkeiten im Detail 320
4.2.3.2.1 Ethanol 320
4.2.3.2.2 Formollösungen 320
4.2.3.2.3 Formol-Alkohol-Gemische 320
4.2.4 Entkalkung 320
4.2.4.1 Entkalkungsprinzipien 321
4.2.4.1.1 Entkalkungstechnik 321
4.2.4.2 Entkalkungszeit 321
4.2.4.3 Beschleunigungsverfahren 322
4.2.4.3.1 Ultraschallentkalkung 322
4.2.4.3.2 Elektrolytische Entkalkung 322
4.2.4.4 Entkalkungsnachbehandlung 322
4.2.4.5 Entkalkungsmedien 322
4.2.4.5.1 Salpetersäure 322
4.2.4.5.2 Trichloressigsäure 323
4.2.4.5.3 Ameisensäure 323
4.2.4.5.4 Pikrinsäure 323
4.2.4.5.5 Zitronensäure 323
4.2.4.5.6 Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat (EDTA) 323
4.2.4.5.7 Schnellentkalkungsmedien 323
4.2.5 Kunststoffeinbettung 323
4.2.5.1 Allgemeines 323
4.2.5.2 Trenn-Dünnschnitt-Technik 324
4.2.5.3 Trenn-Dünnschliff-Technik 324
4.2.5.4 Darstellungstechniken für Trenn-Dünnschnitte oder Trenn-Dünnschliffe 324
4.2.6 Schliffherstellung ohne Vorbehandlung 324
4.2.6.1 Handschleiftechnik 324
4.2.6.2 Maschinelle Schleiftechnik 325
4.2.7 Mazeration von Skelettteilen 325
4.3 Literatur 325
5 Präparationstechniken und Färbungen von Pflanzengewebefür die Lichtmikroskopie 326
5.1 Einführung 326
5.2 Mikroskopische Technik = Mikrotechnik 326
5.2.1 Vorbereitung des Untersuchungsmaterials 326
5.2.2 Wahl des Präparates 326
5.2.3 Fixierung 327
5.2.3.1 Zustand des zu fixierenden Objektes 327
5.2.3.2 Objektgröße 327
5.2.3.3 Lufthaltige Objekte 327
5.2.3.4 Objekte mit schlecht benetzbaren Oberflächen 328
5.2.3.5 Dauer der Fixierung 328
5.2.4 Fixierflüssigkeiten 328
5.2.4.1 Ethanol 328
5.2.4.2 Formol 328
5.2.4.3 Ethanol-Eisessig-Gemische 328
5.2.4.4 Alkohol-Formalin-Eisessig (AFE) 329
5.3 Weiterverarbeitung des fixierten Materials 329
5.3.1 Konservierung 329
5.3.1.1 Konservierungsgemisch nach Strasburger 329
5.3.2 Mazeration 329
5.3.2.1 Natürliche Mazeration 329
5.3.2.2 Physikalische und chemische Mazeration 329
5.4 Herstellen von lichtmikroskopischen Präparaten 330
5.4.1 Basismaterialien zur Herstellung mikroskopischer Präparate 330
5.4.2 Schnitttechnik 330
5.4.2.1 Handschnitte 330
5.4.2.2 Handmikrotome 331
5.4.2.3 Schlittenmikrotome 331
5.4.3 Weiterverarbeitung des Schnittes zu einem lichtmikroskopischen Präparat 332
5.4.3.1 Aufhellung des Präparates 332
5.4.3.2 Färbemethoden 332
5.4.3.3 Färbung der Präparate 333
5.5 Ausgewählte Färbevorschriften 333
5.6 Hämatoxylinlösungen 339
5.7 Einschlussmittel für Dauerpräparate 345
5.7.1 Wasserlösliche Einschlussmedien 345
5.7.1.1 Glycerin 345
5.7.1.2 Glyceringelatine 345
5.7.1.3 Hydromatrix 345
5.7.2 Wasserunlösliche Einschlussmittel 346
5.7.2.1 Euparal 346
5.7.2.2 Eukitt 346
5.7.2.3 Malinol 346
5.8 Literatur 346
6 Präparationstechniken und Färbungen von Protozoen und Wirbellosen für die Lichtmikroskopie 348
6.1 Einführung 348
6.2 Besonderheiten der Untersuchung 348
6.2.1 Bedeutung der Lebendbeobachtung 351
6.2.2 Herabsetzen der Beweglichkeit von Mikroorganismen 351
6.2.3 Vital- und Supravitalfärbungen 351
6.2.4 Betäubung 352
6.2.5 Vorfixierung („Räucherungsmethoden“) 352
6.2.6 Fixieren 356
6.2.7 Vorbehandlung von Weich-und Hartsubstanzen 359
6.2.8 Bemerkungen zu den Organismengruppen 360
6.2.8.1 Protozoen, heterotrophe eukaryotische Einzeller 360
6.2.8.2 Evertebrata, Wirbellose 364
6.3 Literatur 369
7 Cytogenetik 371
7.1 Allgemeines 371
7.2 Chromosomenspreitung 372
7.3 Chromosomenfärbungen 372
7.3.1 Färbung mit Milchsäure-Orcein 372
7.3.2 Q-Bänderung mit Quinacrin 373
7.3.3 Q-Bänderung mit Hoechst 33258 373
7.3.4 Distamycin A/DAPI-(DA/DAPI-) Färbung 374
7.3.5 C-Bänderung mit Giemsa-Färbung 374
7.3.6 G-Bänderung mit Giemsa-Färbung 374
7.4 Fluorochromierung 375
7.5 Histonnachweis 375
7.5.1 Fast Green FCF für Histone 375
7.5.2 Dansylchlorid 375
7.6 Extraktionsmethoden für Nucleinsäuren 376
7.6.1 Säureextraktion 376
7.6.1.1 Perchlorsäure (HCIO4) 376
7.6.1.2 Trichloressigsäure 5–10 % (CCl3 COOH) 376
7.6.1.3 Pikrinsäure 376
7.6.2 Enzymatische Extraktion 376
7.7 Literatur 376
8 Enzymhistochemie 378
8.1 Allgemeines 378
8.1.1 Gewebevorbehandlung 378
8.1.1.1 Fixierung 378
8.1.1.2 Einfrieren von Gewebe, Kryostatschnitte (Kap. 2.7.1) 379
8.1.1.3 Inkubationsmedien 379
8.2 Ausgewählte Methoden von Enzymnachweisen 380
8.2.1 Phosphatasen 380
8.2.1.1 Alkalische Phosphatase 380
8.2.1.2 Saure Phosphatase 382
8.2.1.3 Glukose-6-Phosphatase 383
8.2.1.4 Adenosintriphosphatasen (ATPasen) 384
8.2.2 Carboxylesterhydrolasen 385
8.2.2.1 Unspezifische Esterasen 385
8.2.2.2 Cholinesterasen 385
8.2.3 Oxidasen, Peroxidasen 387
8.2.3.1 Cytochrom-C-Oxidase 387
8.2.3.2 Peroxidase 387
8.2.3.3 Katalase 388
8.2.4 Dehydrogenasen 389
8.2.4.1 Bernsteinsäuredehydrogenase (Succinatdehydrogenase) 389
8.2.4.2 Tetrazoliumreduktasen 390
8.2.5 Transferasen 390
8.2.5.1 Glykogenphosphorylase (nach C. Sewry) 390
8.2.6 Lyasen 391
8.2.6.1 Carboanhydrase (Carbonat-Dehydratase) 391
8.3 Literatur 392
9 Immunlokalisation 393
9.1 Einführung 393
9.1.1 Grundlagen 393
9.1.2 Aufbau und Eigenschaften von Antikörpern 394
9.1.3 Ähnliche Nachweissysteme 394
9.2 Herkunft, Auswahl, Überprüfung und Reinigung von Antikörpern 395
9.2.1 Herstellung von Antikörpern 395
9.2.2 Reinigung von Antikörpern 398
9.3 Nachweismethoden und Detektion 399
9.3.1 Direkte und indirekte Immunmarkierung 399
9.3.2 Auswahl der Antikörper 400
9.3.3 Indirekte Immunmarkierung über Protein A 400
9.3.4 Signalverstärkung durch die (Strept-)Avidin-Biotin-(ABC-)Technik 401
9.3.5 Lokalisation mehrerer Antigene 401
9.3.6 Detektion 402
9.3.7 Signalverstärkung durch Enzym-Anti-Enzym-Komplex-Techniken 407
9.3.8 Tyraminkatalysierte Signalverstärkung 407
9.4 Anforderungen an die Präparate 408
9.4.1 Whole mount-Immunmarkierung und preembedding-Verfahren 408
9.4.2 Markierung an Schnitten 408
9.4.3 Durchführung der Immunmarkierung 409
9.5 Kontrollen und Problembehandlung 412
9.5.1 Antigendemaskierung 412
9.5.2 Blockierung von Aldehydgruppen 414
9.5.3 Verminderung der Autofluoreszenz 414
9.6 Ausgewählte Anleitungen 415
9.6.1 Affinitätsreinigung von Antikörpern 415
9.6.2 Antigendemaskierung 416
9.6.2.1 Wiederherstellung der Antigenität von Schnittpräparaten für die Lichtmikroskopie nach Fixierung in Formaldehyd und Paraffineinbettung 416
9.6.2.2 Antigendemaskierung für die Immunelektronenmikroskopie 417
9.6.3 Immunhistologische Markierungen 418
9.6.4 Immunmarkierungen für die Elektronenmikroskopie 419
9.6.5 Immunmarkierungen für Licht- und Elektronenmikroskopie 419
9.6.6 Silberverstärkung 420
9.6.7 Reduktion der Autofluoreszenz 420
9.6.8 Herstellung von Einbettmedien für Fluoreszenzpräparate 421
9.7 Literatur 422
10 in situ-Hybridisierung 424
10.1 Einleitung 424
10.1.1 Prinzip 424
10.1.2 DNA:DNA-in-situ-Hybridisierung 425
10.1.3 RNA:RNA-in situ-Hybridisierung 427
10.2 Sonden 428
10.2.1 DNA-Sonden 428
10.2.2 RNA-Sonden 429
10.2.3 Sonden für Bakterien- oder Virussequenzen 430
10.3 Markierung der Sonden 430
10.4 Anforderungen an die Präparate 431
10.5 Präparation von Chromosomen und Zellkernen 431
10.6 Vorbehandlung der Präparate 432
10.7 Denaturierung der Nucleinsäuren 432
10.8 Hybridisierung 432
10.8.1 Spezifität der Hybridisierung 432
10.8.2 Stringenz 433
10.8.3 Verminderung von unspezifischer Hintergrundmarkierung 433
10.8.4 Hybridisierungskinetik 433
10.8.5 Kontrollen 434
10.9 Laborausstattung und Reagenzien 434
10.9.1 Ausstattung 434
10.9.2 Reagenzienqualität und- Handhabung 435
10.10 Arbeitsvorschriften 435
10.11 Probleme und Fehlerquellen 450
10.12 Literatur 452
11 Tissue-Printing 454
11.1 Einführung 454
11.2 Generelle Methodik des Tissue-Printing (geeignet für festes Pflanzengewebe) 454
11.3 Tissue-Prints von zartem Gewebe mit Hilfe von Kryostatschnitten 456
11.4 Nachweise an Tissue-Prints 456
11.4.2 Western-Tissue-Print 457
11.4.3 Northern-Tissue-Print 458
11.4.4 Lokalisation von Enzymaktivität am Tissue-Print 459
11.5 Literatur 460
12 Reporterproteine 461
12.1 Einleitung 461
12.1.1 Enzymatische und lichterzeugende Reporter 461
12.1.2 Chemilumineszenz oder Fluoreszenz? 463
12.1.3 Zur Geschichte der FP 463
12.1.4 Grundlegendes zu fluoreszierenden Proteinen 464
12.2 Fluoreszierende Reporter in der Anwendung 467
12.2.1 Konstruktion geeigneter Expressionsvektoren 467
12.2.1.1 Die Wahl des geeigneten Reportergens 467
12.2.1.2 Wichtige cis-Elemente: Promotoren und Enhancer 467
12.2.1.3 Vektoren für die lokalisierte FP-Expression 468
12.2.2 Transiente und stabile Genexpression 468
12.2.3 Fluoreszenzmikroskopie Analyse 470
12.3 Literatur 472
13 Qualitative und Quantitative Analyse in der Mikroskopie 473
13.1 Einleitung 473
13.2 Erstellung mikroskopischer Bilder 473
13.2.1 Digitale Kameras 473
13.2.2 Erstellung der Helligkeitswerte aus einem mikroskopischen Bild 474
13.2.3 Das Nyquisttheorem 475
13.2.4 Verwendung des adäquaten Kameraadapters 476
13.2.5 Kalibrierung 476
13.2.6 Bildformate und Komprimierung 477
13.3 Bildanalyse 478
13.3.1 Konventionelle Verfahren zur Bildanalyse 478
13.3.1.1 Verwendung eines Okularmikrometers 478
13.3.1.2 Verwendung einer Zählkammer 478
13.3.1.3 Stereologische Messungen 480
13.3.2 Digitale Analyse 480
13.3.2.1 Manuelle digitale Messungen 480
13.3.2.2 Automatisierte Messungen 480
13.3.2.3 Spezielle Verfahren in der digitalen Mikroskopie 480
13.3.2.3.1 Aufnahmen von Panoramabildern 480
13.3.2.3.2 Extended Depth of Focus (EDF) 480
13.3.2.3.3 Dekonvolution 482
13.4 Automatisierte Experimentdurchführung mit motorisierten Mikroskopen 482
13.4.1 Motorische Komponenten 482
13.4.2 Mehrdimensionale Mikroskopie 483
13.4.3 Lebendzellmikroskopie 484
13.5 Ausgewählte Verfahren in der modernen Fluoreszenzmikroskopie 484
13.5.1 Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen 484
13.5.1.1 Aufnahme fluoreszenzmikroskopischer Bilder 484
13.5.1.2 Korrekturmechanismen nach der Bildaufnahme 485
13.5.2 Co-Lokalisation 486
13.5.3 Untersuchung der Proteindynamik in lebenden Zellen mit Hilfe fluoreszierender Proteine 486
13.5.4 FRET 488
13.5.5 Quantitative und qualitative Analyse des Fluoreszenzspektrums 490
13.5.6 Quantitative Analyse von Ionenkonzentrationen/Ratio Imaging 491
13.6 Bezugs- und Informationsquellen für Software und Analysemodule 492
13.7 Literatur 493
14 Arbeitsschutz und Sicherheit im histologischen Labor 494
14.1 Einführung 494
14.2 Allgemeines und Grundsätzliches 494
14.3 Sicherheitstechnische Laborausstattung 495
14.4 Notfalleinrichtungen 495
14.5 Persönliche Schutzausrüstung 495
14.6 Hautschutz/Hautschutzplan 496
14.7 Umgang mit Untersuchungsmaterial 496
14.8 Desinfektion 496
14.9 Gefahrstoffe 496
14.9.1 Kennzeichnung von Gefahrstoffen 496
14.9.2 Aufbewahrung, Umgang und Transport von Gefahrstoffen 496
14.9.3 Aufnahmewege von Gefahrstoffen 499
14.9.4 Freisetzung von Gefahrstoffen 499
14.9.5 Gefahrstoffverzeichnis 499
14.9.6 Sicherheitsdatenblätter 499
14.9.7 Betriebsanweisung 499
14.9.8 Unterweisung 501
14.10 Umgang mit Laborabfällen 501
14.11 Umgang mit Mikrotommessern 501
14.12 Brandschutz 501
14.13 Infos zum Arbeitsschutz 502
14.14 Literatur 502
Anhang 1 Tabellen 503
Anhang 2 Aktuelle Bücher zur Mikroskopie 521
Anhang 3 Liste der Anleitungen 524
Index 531