Zell- und Gewebekultur (eBook)

Vorwort zur 5. Auflage 8
Inhalt 10
1 Räumliche und apparative Voraussetzungen, Sicherheitsvorschriften 14
1.1 Der Reinigungsbereich 14
1.2 Der Vorbereitungs- und Verarbeitungsbereich 15
1.3 Der Sterilbereich 16
1.4 Sicherheitsvorschriften und Entsorgung 30
1.5 Generelle Probleme 33
1.6 Literatur 34
2 Kulturgefäße und ihre Behandlung 36
2.1 Züchtung von Zellen auf Glas 36
2.2 Züchtung von Zellen auf Plastikmaterial 37
2.3 Züchtung von Zellen auf anderen Materialien 41
2.4 Spezielle Kulturgefäße 42
2.5 Reinigung und Vorbehandlung von Glaswaren 46
2.6 Vorbehandlung von Kulturgefäßen mit Substanzen zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften 50
3 Steriltechnik – Kontaminationen 54
3.1 Der Sterilbereich 55
3.2 Laborreinigung 56
3.3 Hygiene 56
3.4 Aseptische Arbeitstechnik 56
3.5 Sterilisationsverfahren 61
3.6 Antibiotika 71
3.7 Mycoplasmen 74
3.8 Kreuzkontaminationen 84
3.9 Literatur 85
4 Zellkulturmedien 86
4.1 Herstellung gebrauchsfertiger Medien 86
4.2 Anmerkungen zu einigen Rezepturen 90
4.3 Serumfreie Medien 94
4.4 Zusätze zu Medien 102
4.5 Reinstwasser für Zell- und Gewebekulturen 108
4.6 Literatur 112
5 Routinemethoden zur allgemeinen Handhabung und Subkultivierung von Zellen 114
5.1 Mediumwechsel 114
5.2 Subkultivierung von Monolayerkulturen 117
5.3 Subkultivierung und Suspensionskulturen 122
5.4 Zellzahlbestimmung 123
5.5 Langzeitlagerung und Kryokonservierung von Zellen 128
5.6 Versand von Zellen 133
5.7 Probleme mit Zellen 133
5.8 Literatur 134
6 Primärkulturen 135
6.1 Kultivierung von Herzmuskelzellen des Hühnchens 136
6.2 Kultivierung von Herzmuskelzellen aus neonatalen Rattenherzen 138
6.3 Primärkulturen aus frischen Hautproben (Biopsien) menschlichen Ursprungs 139
6.4 Isolierung von Lymphocyten aus Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation 140
6.5 Primärkulturen aus Mäusecerebellum (Kleinhirn) 142
a 142
c 142
6.6 Gewinnung einer Zellkultur aus soliden Humantumoren 144
6.7 Gewinnung von Keratinocyten 146
6.8 Humane adhärente Zelllinien 150
6.9 Literatur 150
7 Organkulturen 153
7.1 Präparation eines Säugerdünndarms als Beispiel für eine Organpräparation in der Pharmakologie 156
7.2 Präparation eines peripheren Nerven (oberes Halsganglion) zur Messung der neuronalen Übertragung ( Neurotransmission) 158
7.3 Leberschnitte in vitro 160
7.4 Literatur 163
8 Kultur spezieller Zelltypen 164
8.1 Hybridomzellen 164
8.1.1 Prinzipieller Verfahrensablauf 164
8.1.2 Antigene und Adjuvantien 166
8.1.3 Tierwahl für die Immunisierung 166
8.1.4 Immunisierung 166
8.1.5 Kultur der Myelomzellen 166
8.1.6 Konditionierte Medien und „feeder“-Zellen 168
8.1.7 Elektrofusion von Zellen 170
8.1.8 Screening tierischer Hybride 173
8.2 Hepatocyten 174
8.3 Phäochromocytomzellen PC 12 178
8.4 Endothelzellen 179
8.5 Dreidimensionale Zellkultur 184
8.6 Literatur 187
9 Die Massenkultur 190
9.1 Monolayer-Kulturen für große Zellmengen 191
9.1.1 Roller-Kultur 192
9.1.2 Wannen-Stapel (multi-tray, cell factory) 192
9.1.3 Kapillar-Perfusion (Kapillarreaktor, Dialysator) 192
9.1.4 Microcarrier-Kultur (Mikroträger) 193
9.2 Suspensionskultur für große Zellmengen 196
a 197
b c 197
9.2.1 Flasche (Celline) mit Silikonmembran für Suspensionskulturen hoher Dichte 198
9.3 Literatur 198
10 Zellkulturen aus Geweben von Invertebraten und kaltblütigen Vertebraten 199
10.1 Invertebraten 199
10.1.1 Temperatur 199
10.1.2 Atmosphäre 199
10.1.3 Medien 199
10.1.4 Subkultur 200
10.1.5 Suspensionskultur 200
10.1.6 Aufbewahrung und Lagerung 202
10.2 Kaltblütige Vertebraten 203
10.2.1 Fischzellkulturen 203
10.3 Literatur 204
11 Pflanzenzellkulturen 206
11.1 Herstellung von Kulturmedien 206
11.2 Kalluskultur aus teilungsfähigem Pflanzengewebe 210
11.3 Pflanzenzellkulturen als Suspensionskulturen 214
11.4 Isolierung von Einzelzellen und Protoplasten aus Pflanzenzellkulturen 215
11.5 Elektrofusion von Pflanzenprotoplasten 217
11.6 Fusion von Protoplasten mittels Polyethylenglykol 217
11.7 Antherenkultur 220
11.8 Embryonenkultur 223
11.9 Einfrieren von Pflanzenzellsuspensionen 224
11.10 Literatur 226
12 Spezielle Methoden der Zellbiologie 227
12.1 Versuche zur In-vitro-Toxizität 227
12.1.1 Zellkulturmethoden 228
12.1.2 Konzentration der applizierten Substanz in vitro und zeitlicher Verlauf der Applikation 229
12.1.3 Erholungsperiode 230
12.1.4 Endpunkte 230
12.2 Methoden zur In-vitro-Toxizitätsprüfung 233
12.2.1 Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften einer Substanz 233
12.2.2 Prüfung auf akute Zelltoxizität 235
12.2.3 Vitalfärbung zur Testung auf Lebensfähigkeit von Zellen 238
12.2.4 MTT-Test zur Messung von Lebensfähigkeit und Wachstum 239
12.2.5 Nachweis mutagener Substanzen 240
12.3 Transfektion 241
12.3.1 Transfektion nach der Calciumphosphatmethode 241
12.3.2 Transfektion mittels Elektroporation 243
12.3.3 Lipofektion in nicht-adhärenten Zellen 245
12.4 Klonierung 246
12.4.1 Limited-Dilution-Klonierung 246
12.4.2 Klonierung in Weichagar 247
12.4.3 Isolierung von adhärenten Zellklonen 249
12.5 3H-Thymidineinbau als Proliferationskontrolle 250
12.6 Inhibition des Zellwachstums (quantitative Neutralrotmethode) 251
12.7 Ermittlung der Anheftungseffizienz („plating efficiency“) 252
12.8 Virusvermehrung und Transformation mit Epstein-Barr-Viren ( EBV) 254
12.9 Populationsverdopplungszeit 256
12.9.1 Populationsverdopplungszeit bei Suspensionskulturen 257
12.10 Zellsynchronisation 257
12.10.1 Zellsynchronisation durch Abkühlen 257
12.10.2 Zellsynchronisation durch Schütteln 257
12.10.3 Zellsynchronisation durch Colcemid-Block 258
12.10.4 Zellsynchronisation durch Serumentzug 259
12.10.5 Zellsynchronisation durch Isoleucinmangel 259
12.11 Cytometrie 260
12.11.1 Klonierung von Zellen mittels eines FACS 262
12.11.2 Bestimmung der Zellzykluszeit einer proliferierenden Population mittels Bromdesoxyuridineinbaus 264
12.11.3 Bestimmung von verschiedenen Subpopulationen aus peripheren Humanleukocyten 266
12.12 Chromosomenpräparation 267
12.13 Literatur 269
13 Stammzellen 271
13.1 Gewinnung und Kultur hämatopoetischer Stammzellen 271
13.2 Embryonaler Stammzell-Test (EST) (Spezies: Maus) 277
13.2.1 Grundlegende Verfahren 278
13.3 Dezimale geometrische Konzentrationsreihen 289
13.4 Löslichkeit der Testchemikalien 290
13.5 Literatur 291
14 Kleines Zell- und Gewebekulturlexikon 292
14.1 Literatur 306
15 Anhang 307
15.1 Was kann die Ursache von schlechtem Zellwachstum sein? 307
15.2 Berechnungen in der Zellkultur 308
15.3 Nachschlagewerke und Handbücher der Zell- und Gewebekultur 311
15.4 Zeitschriften 313
15.5 Literaturdienst 313
15.6 Institutionen und Firmen, die Zellkulturkurse durchführen 313
15.7 Wissenschaftliche Gesellschaften für Zellkultur 314
15.8 Übersichtswerke zur Beschaffung von Geräten, Labormaterial und Reagenzien 314
16 Lieferfirmen und Hersteller 315
Index 323
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1.3 Der Sterilbereich (S. 3-4)

Dieser Bereich, in dem die eigentlichen Arbeiten an den Zellkulturen durchgeführt werden, ist so sparsam wie möglich auszustatten, um nicht unnötigerweise Platz und Ecken für Kontaminationsmöglichkeiten zu schaffen. Hier sollten nur die sterile Werkbank, der Brutschrank, ein Wasserbad, eine Zentrifuge, ein Umkehrmikroskop und Schränke für die Aufbewahrung von sterilen Gebrauchsgegenständen vorhanden sein. Dazu kommen allgemeine Einrichtungen wie Waschbecken, Gasanschluss und ausreichende Beleuchtung.

1.3.1 Die sterile Werkbank

Die sterile Werkbank, auch Reinraumwerkbank oder Sicherheitswerkbank genannt, ist in dem Sterilbereich möglichst weit entfernt von der Tür aufzustellen. Eine solche Werkbank ist heute eine unbedingte Voraussetzungen zur erfolgreichen Zellzüchtung. Alle anderen Lösungen, wie Arbeiten im Abzug mit UV-Lampe u.Ä. sind unzureichend und schützen nicht zuverlässig vor Kontaminationen. Es gibt eine Vielzahl von Modellen verschiedener Firmen, die aber prinzipiell zwei Typen zuzuordnen sind: Bei der sterilen Werkbank mit horizontaler Luftströmung wird die Luft in der Regel zunächst durch ein Hochleistungsschwebstofffilter (HOSCH-Filter, s. u.) gedrückt, das senkrecht an der Rückwand des Geräts montiert ist, und dann als sterile laminare Verdrängungsströmung horizontal über die Arbeitsfläche geführt (Abb. 1-3).

Diese Geräte sind keine Sicherheitswerkbänke im Sinne der DIN-Norm 12950: „Sicherheitswerkbänke für mikrobiologische und biotechnologische Arbeiten"". Sie dürfen daher für Arbeiten mit Gefährdungspotenzial nicht verwendet werden. Sie sind jedoch für Arbeiten ohne Gefährdungspotenzial durchaus geeignet, z.B. für sterile Präparationen unter einem Stereomikroskop, bei denen es zweckmäßig ist, wenn der Luftstrom herabfallende Partikel vom Präparat wegbläst. Diese Typenklasse ist auch geeignet für die Sterilfiltration ungefährlicher bzw. biologisch unbedenklicher Lösungen und Zubereitungen, wie Zellkulturmedien oder Serumfiltrationen. Die Werkbände sind einfach gebaut, wartungsarm und preisgünstig. Länger dauernde Arbeiten sind meistens unangenehm, weil dem Experimentator ständig Luft ins Gesicht bläst.

Bei der Reinraumwerkbank (Sicherheitswerkbank) mit vertikaler Strömung – zu diesem Typ gehören alle Sicherheitswerkbänke nach DIN 12 950 – wird die Luft entweder vertikal nach oben (Klasse 1) oder vertikal nach unten (Klasse 2) geleitet. Bei der Klasse 1 (Abb. 1-4a) wird die Raumluft ohne Filterung angesaugt und durch ein HOSCH-Filter nach oben in den Raum entlassen. Für steriles Arbeiten sind solche Werkbänke nicht geeignet."