Langzeitkulturen humaner Hepatozyten als Alternative zur Wirkstofftestung in Tierversuchen

Primäre humane Hepatozyten sind, vor allem aufgrund zum Teil großer Speziesunterschiede, weiterhin das in vitro System der Wahl, um leberspezifische Prozesse und Funktionen zu analysieren. In einem zweidimensionalen Kultursystem mit einer optimalen, chemisch definierten und serumfreien Umgebung, in der mehrere der arzneimittelmetabolisierenden Cytochrom P450-Enzyme und leberspezifischen Transkriptionsfaktoren lange exprimiert bleiben, wurden humane Hepatozyten über mehrere Wochen kultiviert. Dabei blieben die hepatozellulären Funktionen der anabolen Albuminsynthese und der katabolen Harnstoffproduktion auf einem konstant hohen Niveau. Die Zugabe der Wachstumsfaktoren HGF und EGF erwies sich dabei als sehr förderlich zur Erhaltung dieser Funktionen.

Das System wurde zur repetitiven Analyse der Wirkung von Acetaminophen auf humane Hepatozyten und Rattenhepatozyten verwendet. Dabei erlaubte die nichtinvasive Bestimmung der Harnstoff- und Albuminkonzentration sowie der Lactatdehydrogenase-Aktivität im Zellkulturüberstand die kontinuierliche Überwachung der Kultur über mindestens zwei Wochen. Acetaminophen in einer Konzentration von 2815 mg/l (18,6 mM) bewirkte in humanen Hepatozyten innerhalb von 24 h eine Absenkung der Harnstoffmenge um etwa 25 % und des synthetisierten Albumins um ca. 70 % bei nicht erhöhter LDH-Aktivität. Ein bis drei Tage nach Entfernung der Substanz erreichten die Funktionen wieder das Niveau der Kontrollzellen. Die Analyse der Wirkungen von Acetaminophen auf den zellulären Metabolismus war repetitiv mit ähnlichen Ergebnissen über mehrere Zyklen jeweils im Abstand von vier Tagen möglich. Der Wirkstoff führte außerdem zu reversiblen und wiederholbaren ultrastrukturellen Modifikationen, insbesondere zu einem nahezu kompletten Austausch des rauen endoplasmatischen Retikulums gegen glattes ER und zu einem Abbau der Glycogenvorräte. Durch vergleichende Inkubationen von primären Rattenhepatozyten mit Acetaminophen wurde die unterschiedliche Empfindlichkeit der Leberzellen verschiedener Spezies belegt. Die in der Mehrzahl bisher veröffentlichter Studien nachgewiesene rasche Depletion des cytoplasmatischen Glutathions konnte in humanen Hepatozyten hier erst mit starker Verzögerung detektiert werden. Der Microarray offenbarte bereits bei einer nicht toxischen Dosis eine Expressionssteigerung Stress-induzierter Gene sowie eine Verlangsamung des zellulären Metabolismus. Im Gegensatz dazu wurde die c-Jun Nterminale Kinase 2 als alleinige stress-aktivierte Proteinkinase erst bei toxischen Substanzkonzentrationen in Rattenhepatozyten deutlich induziert. Neben einer in der real-time PCR bestätigten deutlichen Senkung der Expression der Cytochrome CYP1A2 und CYP3A4 wurden auch die für die Albuminsynthese bedeutenden leberspezifischen Transkriptionsfaktoren HNF1 und HNF4α in ihrer Expression stark reduziert. Die massive Expressionssteigerung der bisher fast ausschließlich in Muskelzellen untersuchten Rad GTPase läßt eine Wechselwirkung von Acetaminophen bzw. seinen Metaboliten mit diesem Enzym vermuten, die einer näheren Charakterisierung bedarf.

Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten demonstrieren die Möglichkeit, das Kultursystem als Modell zur wiederholten Prüfung von fremdstoffinduzierten Veränderungen hepatozellulärer Funktionen einzusetzen und damit die Anzahl von Tierversuchen während der Wirkstoffentwicklung zu reduzieren.